發(fā)布時間：2019-04-11 16:54

【摘要】：蛋白質(zhì)生物分子進(jìn)行進(jìn)化以來已經(jīng)歷經(jīng)數(shù)十年,一般目標(biāo)分子的進(jìn)化必需經(jīng)歷如下過程：目標(biāo)分子基因水平DNA序列隨機(jī)化(建DNA庫),利用感受態(tài)轉(zhuǎn)化方法將DNA庫導(dǎo)入宿主菌(建有生物活性庫),根據(jù)與靶標(biāo)分子相互作用結(jié)合能力強(qiáng)弱不同篩選出陽性突變體(篩選),將篩選獲得DNA分子再次轉(zhuǎn)入宿主菌,進(jìn)行下一輪篩選,循環(huán)往復(fù),直至最終獲得期望性能的一個甚至數(shù)個突變體,完成目標(biāo)分子定向進(jìn)化。本課題選擇傳統(tǒng)噬菌體展示技術(shù)這種體外進(jìn)化方法對人源化抗ErbB2抗體HuA21進(jìn)行親和力改造。 幾十年來,噬菌體展示技術(shù)被廣泛用于抗體親和力成熟。隨著技術(shù)的發(fā)展,其更有效更廣泛的應(yīng)用卻受限于兩點：抗體庫序列有限的多樣性和對篩選后高親和力抗體突變體冗余復(fù)雜且耗時的鑒定。本課題我們將介紹一種新型的抗體庫構(gòu)建和篩選方法用以解決該問題。首先,利用微擾突變(SPM)的方法對該人源化抗ErbB2抗體,HuA21的多個CDR區(qū)分別進(jìn)行定點多樣化：用NWG, NWC, NSG三類簡并密碼子引入氨基酸飽和突變能夠同時避免引入半胱氨酸和終止密碼子。在兩塊芯片上共合成并洗脫了7749條簡并寡核昔酸用以構(gòu)建五個單鏈抗體庫(ScFv),其總庫容為4×106DNA序列多樣性。通過Illumina平臺對未篩選及篩選后的噬菌體庫進(jìn)行高通量測序使我們能夠深度了解CDR序列及氨基酸組成的豐度。高通量測序技術(shù)用于鑒定篩選后有效的高親和力抗體,這樣能夠跨過初級的靶標(biāo)特異性鑒定過程。為了判斷高通量測序鑒定方法的可信度,我們隨后綜合HTS結(jié)果中四個CDR庫的前十個豐度最高的序列構(gòu)建了一個組合庫并進(jìn)行篩選,最終獲得了親和力提高158倍(Kd=25.5pM)的一個抗體突變體。這些結(jié)果預(yù)示我們的方法在優(yōu)化抗體和其他生物分子結(jié)合能力方面的潛在應(yīng)用。 該傳統(tǒng)體外展示用以進(jìn)化的方法其不足之處在于受限于構(gòu)建的突變庫的庫容、篩選的有效性,并且每一輪篩選都需要連續(xù)的人力輸入,低效而且耗時。近幾年,David R Liu實驗室創(chuàng)建的PACE系統(tǒng)(phage assisted continuous directed evolving)在快速簡化生物大分子定向進(jìn)化上功效頗高,能幫助研究者解決如上傳統(tǒng)進(jìn)化方法必然出現(xiàn)的問題。該PACE定向進(jìn)化系統(tǒng)包括一個體積固定的培養(yǎng)瓶,新鮮的宿主菌源源不斷的流入,被大瓶中預(yù)置的包含靶標(biāo)基因的噬菌體侵染后該噬菌體/宿主菌混合物再源源不斷流出。該系統(tǒng)將噬菌體侵染能力與靶標(biāo)基因的特定功能偶聯(lián),使得特定噬菌體的富集依賴于靶標(biāo)基因的功能提高。所以,噬菌體復(fù)制/侵染一代就等于傳統(tǒng)方法中的一輪突變篩選而且不需要人力投入。但是近幾年P(guān)ACE系統(tǒng)自被報道以來,其發(fā)展僅局限于David R Liu一處實驗室,廣泛使用有待發(fā)展。因此,本課題中,我們在本實驗室嘗試用PACE系統(tǒng)定向進(jìn)化rpoD基因(Sigma70因子)使其編碼蛋白最終能夠和無關(guān)DNA序列有較強(qiáng)且特異性的相互作用。我們計劃構(gòu)建該系統(tǒng)后將其用于人工合成無功能蛋白的功能賦予。目前我們還在進(jìn)一步的摸索實驗來搭建該系統(tǒng)。
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【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392

【引證文獻(xiàn)】

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本文編號：2456592