【摘要】：白念珠菌(Candida albicans)是一種常見的人體病原真菌,存在于大部分正常人的口腔、上呼吸道、腸道及陰道等黏膜組織和臟器中,是一種機會性致病真菌。通常情況下白念珠菌不會引起人體疾病,當機體免疫功能或一般防御力下降、以及宿主體內(nèi)正常菌群相互制約作用失衡時,則會引起念珠菌病。近年來,隨著現(xiàn)代醫(yī)學技術(如免疫抑制和器官移植等)的廣泛應用,白念珠菌感染的比例呈現(xiàn)出明顯增長的趨勢。白念珠菌能夠成為人體內(nèi)成功的條件性致病真菌的一個重要原因是它具有形態(tài)可塑性(phenotypic plasticity)這樣一個顯著特征。這種形態(tài)可塑性體現(xiàn)在白念珠菌能夠以不同形態(tài)存在,比如,酵母形態(tài)、菌絲形態(tài)、white和opaque形態(tài)等。在一定的條件下,白念珠菌可以在不同的形態(tài)之間相互轉(zhuǎn)換,以更好的適應環(huán)境的變化。最為典型的兩種形態(tài)轉(zhuǎn)變系統(tǒng)為酵母(Yeast)-菌絲(Filaments)、white-opaque之間的相互轉(zhuǎn)換。白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)變是一個非常復雜的過程,這種形態(tài)轉(zhuǎn)換與白念珠菌的致病性是直接相關的。因此,深入研究白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)換分子機理將有助于更好的認識其致病機理,有助于未來對念珠菌病的治療提供新的思路。本研究以揭示白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)換的分子調(diào)控機理為目的,對鋅指結構轉(zhuǎn)錄因子Off1以及高親和性鐵離子滲透酶Ftr1和Ftr2在白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)換過程中的調(diào)控作用進行研究。主要研究結果如下：1.OFI1基因的分子特征及其表達譜分析白念珠菌的基因orf 19.4972 (GeneBank accession:68467498)是一個功能未知基因,我們將之命名為OFI1 (opaque and filamentation inducer 1)。其ORF框編碼含有648個氨基酸殘基的蛋白,其分子量為71262 Da,等電點為9.41。通過對氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn),Ofil蛋白含有3個串聯(lián)的C2H2型鋅指結構基序(ZnF_ C2H2, aa97-119, aa 125-147, and aa 153-173),表明Off1具有結合DNA的能力。通過對多個包括microarray和RNAseq在內(nèi)的高通量數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),orf9.4972在白念珠菌opaque細胞中的轉(zhuǎn)錄水平均高于white細胞。利用RT-qPCR進行驗證,結果顯示opaque田胞中OFI1的表達水平是white細胞中OFI1表達水平的近120倍。2.Ofil在白念珠菌white-opaque形態(tài)轉(zhuǎn)換中的功能通過將OFI1基因置于ACT1啟動子下進而構建了過表達質(zhì)粒,將質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)入白念珠菌野生型菌株WUM5A中構建了OFI1過表達菌株,并通過RT-qPCR驗證了過表達菌株中OFI1的表達水平顯著性的高于對照菌株的相同形態(tài)細胞中的表達水平。隨之,進行了white-opaque轉(zhuǎn)換頻率實驗,結果顯示,在野生型細胞中過表達OFI1后,在Lee's Glucose以及Lee's GlcNAc培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)后,白念珠菌opaque形成的比例都顯著性地增強,也就是white向opaque轉(zhuǎn)換的頻率增加了,尤其是在Lee's GlcANc培養(yǎng)基上,OFI1過表達使得白念珠菌幾乎100%地由white細胞變?yōu)閛paque形態(tài)的細胞。但是opaque向white轉(zhuǎn)換的頻率卻沒有因為OFI1的過表達而受到顯著的影響,暗示OFI1的過表達對于將細胞維持在opaque狀態(tài)的作用并不大。關鍵基因WOR1的敲除使得白念珠菌很難由white向opaque形態(tài)轉(zhuǎn)換,細胞被鎖定在white狀態(tài)。為了進一步確定OFI1與WORl的關系,我們在WOR1缺失株中過表了OFI1基因,white-opaque轉(zhuǎn)換實驗結果顯示,在缺失關鍵調(diào)控因子Wor1的情況下,OFI1的過表達并不能恢復細胞由white向opaque形態(tài)轉(zhuǎn)換的能力。因此,Off1可能并不能單獨行使對這種形態(tài)轉(zhuǎn)換的調(diào)節(jié)功能,而是需要與其它受到Wor1調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子一起才能發(fā)揮作用。此外,還構建了OFI1基因的缺失株及其回補菌株,通過統(tǒng)計white-opaque形態(tài)轉(zhuǎn)化頻率發(fā)現(xiàn),OFIl基因的缺失雖然不能夠阻止white向opaque形態(tài)的轉(zhuǎn)換,但是在Lee's GlcNAc培養(yǎng)基上,其缺失能夠降低white向opaque的轉(zhuǎn)換頻率,這與OFI1基因過表達促進white向opaque轉(zhuǎn)換的結果是一致的。但是,無論是過表達OFI1還是敲除OFI1,其對opaque形態(tài)的維持并不是那么重要,對opaque向white的轉(zhuǎn)變頻率沒有顯著性影響。綜合這些結果,OFI1對white-opaque形態(tài)轉(zhuǎn)換的調(diào)節(jié)功能雖然沒有基因WOR1的功能強,但是它在整個white-opaque形態(tài)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡中占有自己的位置,與其它功能還未知的調(diào)控因子一起,影響著white-opaque的形態(tài)轉(zhuǎn)換,對其進行微調(diào)的作用。3.Ofi1在白念珠菌菌絲生長和侵入性生長過程中的作用除了對Off1在white-opaque形態(tài)轉(zhuǎn)換中的功能研究,我們還對Off1在白念珠菌菌絲生長過程中是否發(fā)揮作用進行了研究。同樣的,在野生對照株CAI4中過表達了OFI1,并在不同的培養(yǎng)條件下進行菌絲生長實驗。培養(yǎng)條件包括三種培養(yǎng)基(Lee's Glucose、Lee's GlcNAc和Spider)和三種溫度條件(25℃、30℃和37。C)。低溫25。C不宜于菌絲的生長。在25℃培養(yǎng)條件下,在Lee's Glucose培養(yǎng)基和Spider培養(yǎng)基上,OFI1的過表達顯著性的促進了菌絲的生長。30℃培養(yǎng)條件下,在Lee's Glucose和Spider培養(yǎng)基上,OFI1的過表達能促進菌絲的生長,但由于GlcNAc是促進白念珠菌菌絲生長的重要環(huán)境因子,在Lee'GlcNAc培養(yǎng)基上,對照菌株的菌絲也呈現(xiàn)出大量的生長,很難比較過表達菌株與對照菌株的菌絲生長能力。高溫37。C是白念珠菌容易進行菌絲生長的溫度條件,在37。C培養(yǎng)條件下,所有培養(yǎng)基上的對照菌株均能進行大量的菌絲生長,難以區(qū)別對照菌株和OFI1過表達菌株菌絲生長能力的強弱。在WOR1基因突變體中過表達OFI1是不能促進white向opaque形態(tài)轉(zhuǎn)換的,因此OFI1過表達對white-opaque形態(tài)轉(zhuǎn)變的促進作用是依賴于WOR1的。OFI1過表達對菌絲生長的促進作用是否也是依賴于WOR1?基于這樣的問題,我們對wor1-/-突變體中過表達了OFI1的菌株進行了菌絲生長能力實驗。結果顯示在Spider培養(yǎng)基上,不論是25℃培養(yǎng)還是30℃培養(yǎng),wor1-/-突變株中過表達OFI1能夠非常明顯的促進菌絲的形成；Lee's Glucose培養(yǎng)基上,25℃培養(yǎng)條件下,在worl-/-突變體中過表達OFI1對菌絲生長的影響不大,但是30℃培養(yǎng)條件下,過表達菌株菌絲的生長能力強于對照菌株。而在Lee's GlcNAc培養(yǎng)基上過表達菌株和對照株的菌絲生長能力都很強。因此,過表達OFI1能夠在一定的條件下促進菌絲生長,并且這種促進作用是不依賴于WOR1基因的表達。但是,通過對OFI1缺失菌株和回補株進行菌絲生長實驗發(fā)現(xiàn),在各個不同培養(yǎng)條件下,該基因的缺失對白念珠菌菌絲生長并不能產(chǎn)生顯著性影響,因此OFI1基因并不是菌絲生長所必須的。白念珠菌侵入生長的能力被認為是感染宿主初期時穿透組織所需要的。菌絲的生長與其侵入生長能力是密切相關的。為了驗證這一點,我們對過表達菌株的侵入生長能力進行了實驗。結果顯示在25℃培養(yǎng)條件下,OFI1過表達菌株的侵入生長能力顯著性增強。但是在30℃和37℃度的條件下,所有菌株都能進行侵入生長,因此OFIl過表達對菌株侵入生長的影響在較低溫度下更加顯著。4.高親和性鐵離子滲透酶Ftrl和Ftr2調(diào)控白念珠菌生長和形態(tài)發(fā)生微量元素鐵對于幾乎所有生物的生長都是必須的。白色念珠不僅能生存于鐵含量豐富的環(huán)境,比如人體腸道系統(tǒng),還能生存于鐵含量極低的環(huán)境,比如血液中。Ftr1和Ftr2是目前已知的白念珠菌中兩種對鐵離子具有高親和性的滲透酶,分別編碼381和382個氨基酸的蛋白。兩者具有高達83%的同源性,含有多個跨膜區(qū)和鐵離子結合區(qū),但其生物學特性卻并不相同。FTR1在鐵含量受限的時候表達量升高,而在鐵含量比較豐富的情況下其表達水平是被抑制的；FTR2的表達情況正好相反。在低鐵環(huán)境中,僅Ftr1行使高親和性鐵攝取活性,并對白念珠菌的生長產(chǎn)生影響,此外,Ftrl對于白念珠菌感染宿主并產(chǎn)生毒性非常關鍵,該基因的缺失使得菌株不能有效地對宿主產(chǎn)生感染。而Ftr2對白念珠的生理活動及毒理效應并不清楚。環(huán)境中鐵的豐度對白念珠菌菌絲生長、腸道中共生及致病能力都有一定的影響。但是,目前對高親和性鐵離子滲透酶在白念珠菌菌絲生長中的功能還沒有進行過系統(tǒng)的研究。Ftrl和Ftr2與菌絲生長是否存在相關性,并未可知。我們對FTR1、FTR2基因缺失株在不同培養(yǎng)條件下的生長情況以及菌絲生長能力進行分析,明確了高親和性鐵離子滲透酶在白念珠菌生長和形態(tài)發(fā)生中的功能。通過將不同基因型的菌株分別置于不同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)溫度下進行培養(yǎng),對其生長速度以及菌絲的生長狀態(tài)進行觀察。結果顯示,在所有測試過的培養(yǎng)條件下,FTR1或FTR2單基因缺失對于白念珠菌的生長沒有顯著的影響,但是FTR1、FTR2雙基因缺失使白念珠菌在Spider培養(yǎng)基中不能生長,鐵離子的添加能夠恢復該雙基因缺失株的生長能力；FTR1、FTR2雙基因缺失株在營養(yǎng)貧瘠的合成培養(yǎng)基上生長速度也較慢；ftr1/frt1菌株的菌絲生長能力增強,而ftr2/ftr2菌株的菌絲生長能力減弱。雙基因突變株ftr1/ftr1 ftr2/ftr2的菌絲生長能力能夠恢復到野生對照株的水平。這些結果提示Ftrl對白念珠菌菌絲生長起負調(diào)控作用,Ftr2對菌絲生長起正調(diào)控作用。同時,Ftrl與Ftr2不僅對白念珠菌在微量鐵元素環(huán)境中的生存有著重要的作用,還參與了白念珠菌對碳源N-乙酰葡萄糖胺、乙醇和甘油等的利用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R379.4

【共引文獻】

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本文編號：2455917