【摘要】：人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)是巨細(xì)胞包涵體病的病原體。HCMV在自然界普遍存在,屬于β皰疹病毒屬,具有嚴(yán)格的種屬特異性,人是該病毒的唯一宿主。該病毒復(fù)制周期長(zhǎng),尤其是在細(xì)胞培養(yǎng)中病毒復(fù)制非常緩慢。HCMV具有208個(gè)開(kāi)放讀碼框架,能編碼200余種多肽,這使該病毒致病機(jī)理和宿主關(guān)系的研究復(fù)雜困難。HCMV可在感染者體內(nèi)長(zhǎng)期潛伏存在,能通過(guò)垂直或者水平傳播,感染病毒后常無(wú)明顯的臨床癥狀表現(xiàn)。當(dāng)機(jī)體免疫功能低下時(shí),HCMV則從潛伏狀態(tài)進(jìn)入活化狀態(tài)并大量復(fù)制,進(jìn)而出現(xiàn)間質(zhì)性肺炎、不典型淋巴細(xì)胞增多、視網(wǎng)膜炎、肝炎、結(jié)腸炎和腦膜腦炎等,可導(dǎo)致嚴(yán)重的移植物排斥和多器官衰竭,甚至死亡。關(guān)于HCMV活化復(fù)制的假說(shuō)包括:缺血/缺氧假說(shuō)、器官移植假說(shuō)、輻射損傷假說(shuō)、炎癥因子假說(shuō)等。這些研究都是在特定條件下研究某個(gè)因素對(duì)HCMV的影響,并不能從根本上闡釋HCMV活化復(fù)制的機(jī)制。目前針對(duì)HCMV感染,多采用更昔洛韋、纈更昔洛韋、膦甲酸和昔多呋韋等,但臨床上仍不能有效控制HCMV導(dǎo)致的不良結(jié)局,且長(zhǎng)時(shí)間使用這類藥物會(huì)使患者出現(xiàn)嚴(yán)重的毒副反應(yīng),也會(huì)加速HCMV耐藥株的產(chǎn)生。因此,探索HCMV復(fù)制及其相關(guān)生理過(guò)程對(duì)防控HCMV感染至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn),受HCMV侵害人群中的一個(gè)共同特點(diǎn)是氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡而表現(xiàn)出高水平的氧化應(yīng)激狀態(tài)。與此同時(shí),細(xì)胞在氧化應(yīng)激形成過(guò)程中親環(huán)蛋白A(cyclophilin A,CyPA)的表達(dá)也隨之增強(qiáng),該過(guò)程也可同時(shí)激活p38-MAPK信號(hào)通路,促進(jìn)下游轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。p38-MAPK信號(hào)通路激活的轉(zhuǎn)錄因子可能與HCMV立即早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子(major immediate early promoter/enhancer,MIEP)區(qū)域結(jié)合,進(jìn)而促進(jìn)下游HCMV基因的轉(zhuǎn)錄。然而,氧化應(yīng)激通過(guò)CyPA激活p38-MAPK信號(hào)通路以及其對(duì)HCMV復(fù)制的影響尚不明確。因此,我們期望通過(guò)細(xì)胞內(nèi)、外過(guò)氧化氫刺激誘導(dǎo)細(xì)胞形成氧化應(yīng)激,并在此基礎(chǔ)上,觀察氧化應(yīng)激及抗氧化劑對(duì)病毒復(fù)制的影響,明確氧化應(yīng)激與病毒復(fù)制之間的關(guān)系;通過(guò)分析在氧化應(yīng)激條件下CyPA的基因和蛋白表達(dá),進(jìn)一步探索CyPA在氧化應(yīng)激促進(jìn)病毒復(fù)制過(guò)程中的作用,明確CyPA與氧化應(yīng)激和病毒復(fù)制的關(guān)系;與此同時(shí),探索過(guò)氧化氫刺激對(duì)p38-MAPK信號(hào)通路的影響,并明確該通路與HCMV復(fù)制之間的關(guān)系,為研究宿主與病毒復(fù)制之間關(guān)系和防治HCMV感染提供新的思路和方向。具體研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:一、細(xì)胞氧化應(yīng)激模型建立。通過(guò)細(xì)胞外給予過(guò)氧化氫和細(xì)胞內(nèi)抑制過(guò)氧化氫酶活性的方式,提升細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫促進(jìn)細(xì)胞氧化應(yīng)激形成。經(jīng)ata處理后,細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫酶活性受到抑制,細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫濃度也隨之升高;檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平,發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激水平隨過(guò)氧化氫濃度增加而升高;western-blot檢測(cè)抗氧化相關(guān)因子nrf2隨過(guò)氧化氫濃度增加而發(fā)生核移位,證實(shí)細(xì)胞內(nèi)、外過(guò)氧化氫可促進(jìn)氧化應(yīng)激的形成。二、氧化應(yīng)激對(duì)hcmv在體外和體內(nèi)復(fù)制的影響在氧化應(yīng)激細(xì)胞模型基礎(chǔ)上,一方面觀察細(xì)胞外過(guò)氧化氫對(duì)hcmv復(fù)制的影響,另一方面抑制細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫酶觀察細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫對(duì)hcmv復(fù)制的影響,進(jìn)而明確氧化應(yīng)激與hcmv復(fù)制之間的關(guān)系。雙熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示,過(guò)氧化氫能促進(jìn)hcmvmiep的活性,并具有劑量效應(yīng)關(guān)系;通過(guò)qrt-pcr檢測(cè)病毒ie基因表達(dá),western-blot檢測(cè)pp72和pp65蛋白的表達(dá),定量pcr檢測(cè)培養(yǎng)上清中病毒顆粒以及病毒滴度均說(shuō)明氧化應(yīng)激能夠促進(jìn)hcmv在細(xì)胞中的復(fù)制。在此基礎(chǔ)上,運(yùn)用nac抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激形成,觀察抗氧化對(duì)hcmv復(fù)制的影響。結(jié)果顯示,采用抗氧化劑干預(yù)后細(xì)胞氧化應(yīng)激水平受到抑制,也抑制了過(guò)氧化氫增強(qiáng)的miep的活性,繼而影響ie基因、pp72和pp65蛋白的表達(dá)以及病毒的滴度;在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,nac也能抑制鼠巨細(xì)胞病毒(murinecytomegalovirus,mcmv)感染時(shí)mcmv在血液中的載量以及唾液腺及肺組織中的病毒滴度,這些結(jié)果印證了抗氧化劑能抑制由過(guò)氧化氫增強(qiáng)的hcmv復(fù)制增強(qiáng)。因此,上述結(jié)果說(shuō)明了氧化應(yīng)激同hcmv復(fù)制之間的關(guān)系,但宿主細(xì)胞調(diào)控hcmv復(fù)制的機(jī)制尚需進(jìn)一步探索。三、cypa對(duì)氧化應(yīng)激促進(jìn)hcmv復(fù)制增強(qiáng)的影響在氧化應(yīng)激促進(jìn)hcmv的復(fù)制過(guò)程中,在基因和蛋白水平也觀察到氧化應(yīng)激增強(qiáng)了宿主細(xì)胞cypa的表達(dá)。當(dāng)氧化應(yīng)激水平受到抑制時(shí),cypa表達(dá)也隨之下降,說(shuō)明cypa表達(dá)受氧化應(yīng)激的調(diào)控,提示宿主細(xì)胞的cypa可能參與了hcmv的復(fù)制;為研究cypa與病毒復(fù)制之間的關(guān)系,通過(guò)慢病毒感染并篩選穩(wěn)定表達(dá)干擾cypa的細(xì)胞株;給予穩(wěn)定干擾cypa細(xì)胞過(guò)氧化氫刺激,發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激不能再增強(qiáng)hcmvmiep的活性,同時(shí)病毒的ie基因表達(dá),蛋白表達(dá)以及病毒顆粒產(chǎn)生也均受到抑制;采用環(huán)孢菌素a(cyclosporinea,csa)抑制cypa的酶活性,在未改變細(xì)胞氧化應(yīng)激水平和cypa水平的條件下,csa通過(guò)抑制cypa的酶活性抑制了過(guò)氧化氫增強(qiáng)的miep活性以及病毒ie基因和蛋白表達(dá);在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,給予csa抑制了mcmv急性感染時(shí)病毒在血液中的載量以及唾液腺和肺組織中病毒的滴度。結(jié)果說(shuō)明,cypa在氧化應(yīng)激增強(qiáng)的hcmv復(fù)制中起著重要的輔助因子作用。四、p38-mapk信號(hào)通路對(duì)hcmv復(fù)制的調(diào)控過(guò)氧化氫刺激細(xì)胞后,Western-blot檢測(cè)不同過(guò)氧化氫作用時(shí)間和作用濃度對(duì)細(xì)胞p38活性的影響,發(fā)現(xiàn)200μM過(guò)氧化氫刺激1h后,p38的磷酸化水平顯著上調(diào),6h后升至高點(diǎn);同時(shí)在25μM過(guò)氧化氫刺激下,p38出現(xiàn)磷酸化,隨著濃度的增加,p38磷酸化水平也隨之升高;采用NAC以及p38抑制劑SB203580后,氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的p38磷酸化效應(yīng)受到抑制,進(jìn)一步說(shuō)明氧化應(yīng)激促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)p38的磷酸化;并在干擾或抑制CyPA后觀察發(fā)現(xiàn),CyPA也參與了氧化應(yīng)激促進(jìn)p38磷酸化的過(guò)程;為驗(yàn)證p38對(duì)HCMV復(fù)制的影響,利用SB203580預(yù)處理細(xì)胞,結(jié)果顯示,SB203580能夠抑制過(guò)氧化氫增強(qiáng)的HCMV復(fù)制;干擾或抑制CyPA后,p38在磷酸化水平受到抑制的同時(shí)HCMV的復(fù)制也受到抑制。綜上,本研究全面探索了氧化應(yīng)激對(duì)HCMV復(fù)制的影響,揭示了氧化應(yīng)激是促進(jìn)HCMV在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的關(guān)鍵因素;體內(nèi)和體外結(jié)果共同證實(shí)抗氧化劑是控制病毒感染復(fù)制的一種有效方式;干擾或抑制CyPA可阻礙氧化應(yīng)激促進(jìn)的病毒復(fù)制,說(shuō)明CyPA是病毒復(fù)制中的重要輔助因子;從機(jī)制上闡明p38-MAPK信號(hào)通路在氧化應(yīng)激與HCMV復(fù)制之間發(fā)揮重要作用,總結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提出ROS→CyPA→p38-MAPK→HCMV的通路,對(duì)深入開(kāi)展HCMV致病機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)支撐,為研發(fā)防治HCMV復(fù)制的藥物提供新思路和新策略,也為防治HCMV感染提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R373

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本文編號(hào)：2455380