【摘要】：研究背景及目的采用均相化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)研制CA125的定量檢測(cè)試劑,評(píng)價(jià)各項(xiàng)性能指標(biāo);同時(shí),研制了基于該免疫分析技術(shù)細(xì)胞裂解液中分析JAK1和IL-2RB,JAK1和IL-10RA相互作用的核心原料和分析試劑。方法1研制CA125的均相化學(xué)發(fā)光定量免疫分析試劑1.1參考標(biāo)準(zhǔn)品的配制:用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液將CA125抗原配置成1,12,34,118,310,670U/mL系列參考品溶液,每管1mL于-20 ℃保存,融化后于4 ℃保存,避免反復(fù)凍融。1.2抗體與發(fā)光微球的連接:CA125的配對(duì)標(biāo)記抗體200 μg加入到超濾管中,以8,000 rpm離心6 min,用抗體與受體微球的連接緩沖液洗滌5次。CA125的包被抗體分別取30,50,70,100μg與1 mg發(fā)光微球連接,加入10 μL的抗體與受體微球連接溶液,1.25μL的10%Tween-20,37 ℃避光震蕩48 h。加入10 μL的封閉液封閉結(jié)合位點(diǎn)。37 ℃避光孵育1h后離心洗滌。將連接抗體的微球溶液調(diào)整濃度為5 mg/mL。1.3生物素與抗體的連接:將CA125的配對(duì)包被抗體100μg加入到超濾管中,以8,000 rpm離心6 min,用生物素標(biāo)記緩沖液洗滌5次,加入0.5 μL的22 mg/mL的活化生物素,用生物素標(biāo)記緩沖液定容至200 μL,室溫孵育2 h。將連接產(chǎn)物加入超濾管,用生物素保存液洗滌5次,最后收集超濾管中液體,并將濃度調(diào)整至5 mg/mL。1.4試劑性能指標(biāo)的評(píng)價(jià):包括標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制,靈敏度,特異性實(shí)驗(yàn),回收率,干擾實(shí)驗(yàn)及與國(guó)外試劑盒的比較實(shí)驗(yàn)等。2 研制均相化學(xué)發(fā)光定量免疫分析JAK1和IL-2RB,JAK1和IL-10RA相互作用的核心原料和分析試劑2.1從Hela細(xì)胞中提取總RNA,通過(guò)RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄cDNA,擴(kuò)增IL-2RB,IL-10RA。經(jīng)雙酶切、連接、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化、挑克隆及質(zhì)粒提取,得到重組質(zhì)粒 pENTER-IL-2RB-His 和 pENTER-IL-10RA-His。2.2 重組質(zhì)粒 pENTER-IL-2RB-His 和 pENTER-IL-10RA-His 的 PCR、雙酶切、測(cè)序鑒定。2.3重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染、間接免疫熒光和免疫印跡檢測(cè)IL-2RB和IL-10RA蛋白的真核表達(dá)。2.4免疫共沉淀檢測(cè)JAK1和IL-2RB、JAK1和IL-10RA的相互作用。2.5均相化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)JAK1-IL-2RB、JAK1-IL-10RA的蛋白相互作用。結(jié)果1自制的CA125均相化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑的分析靈敏度為0.29 U/mL。分析內(nèi)和分析間的變異系數(shù)分別為4.4%-6.8%,9.9%-12.7%。自制試劑臨床血清樣本值與化學(xué)發(fā)光法的測(cè)值具有良好的相關(guān)性。2 經(jīng)PCR、雙酶切鑒定IL-2RB和IL-10RA重組質(zhì)粒為陽(yáng)性克隆,并且在293T細(xì)胞中成功表達(dá),免疫印跡可在對(duì)應(yīng)的位置看到目的蛋白條帶。3基于CA125均相化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù),當(dāng)受體發(fā)光微球連接抗體為30 μg時(shí),能夠檢測(cè)出JAK1-IL-2RB,JAK1-IL-10RA的相互作用。結(jié)論自制的CA125均相化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑的各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到檢測(cè)試劑的要求,為研制腫瘤標(biāo)記物CA125試劑盒提供了核心原料,也為其他均相化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑的研制提供了技術(shù)支持。成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pENTER-IL-2RB-His 和 pENTER-IL-10RA-His,并在 293T 細(xì)胞中成功表達(dá)。共轉(zhuǎn)染JAK1和IL-2RB,JAK1和IL-10RA質(zhì)粒的細(xì)胞裂解液中用免疫共沉淀和新型均相化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)也可以檢測(cè)出其相互作用。這為進(jìn)一步研究JAK1蛋白及通路蛋白相互作用奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:The background and purpose of the study were to develop a quantitative detection reagent for CA125 by homogeneous chemiluminescence immunoassay, and to evaluate the performance indexes. At the same time, the core raw materials and analytical reagents for the interaction of JAK1 and IL-2RB, JAK1 and IL-10RA in the cell lysis solution based on the immune analysis were developed. Method 1 The preparation of a homogeneous chemiluminescent immunoassay reagent for CA125 was developed: 1, 12, 34, 118, 310, 670U/ mL series of reference solutions were prepared by standard dilution, and 1mL per tube was stored at-20.degree. C. and then stored at 4 鈩，

本文編號(hào)：2396032