【摘要】：目的肝臟是機體內(nèi)非常重要的代謝器官,承擔機體物質(zhì)轉(zhuǎn)化、糖原合成和解毒等功能。由于含有大量天然和獲得性免疫細胞,肝臟也是非常特殊的免疫器官。在胚胎時期,胎肝是最重要的造血器官之一,而在出生后,造血干細胞及造血過程幾乎全轉(zhuǎn)移到骨髓,骨髓成為最主要和最重要的造血器官,能生成和維持全身的血細胞。而肝臟的造血功能逐漸降低,但是最近研究顯示,成年后肝臟中仍然存在少量造血干細胞。移植轉(zhuǎn)輸實驗證明,這些肝臟造血干細胞保留了一定的造血能力,可以分化發(fā)育到各種成熟免疫細胞。成年肝臟的造血干細胞是肝臟中發(fā)育分化而來還是來源于骨髓,以及在某些病理狀態(tài)下尤其是骨髓功能抑制時,可否在一定程度上提供代償性的造血作用,這些問題值得關(guān)注。造血干細胞發(fā)揮造血功能依賴于造血微環(huán)境,骨髓微環(huán)境中存在許多調(diào)控造血過程的細胞和因子。作為天然免疫應答和獲得性免疫應答等過程中重要的細胞因子,γ干擾素(interferon-gamma,IFN-γ)被報道參與骨髓的造血調(diào)控,包括調(diào)節(jié)造血干細胞的形成過程、增殖能力、自我更新及分化發(fā)育。那么,IFN-γ在肝臟微環(huán)境中是否也對肝臟造血干細胞的存活或者發(fā)育分化具有一定的影響呢?本課題針對此問題設(shè)計了相關(guān)實驗,并同時以骨髓作為參照對比,首先通過半固體培養(yǎng)基集落形成實驗我們發(fā)現(xiàn)了 IFN-γ確實對肝臟單個核細胞和造血干細胞(LSK細胞)集落形成能力有抑制作用,同時缺失IFN-y的小鼠肝臟單個核細胞具有更強的集落形成能力。其次,我們進一步通過多色流式細胞術(shù)對比正常小鼠、IFN--γ缺失小鼠和體內(nèi)過表達IFN-γ小鼠的肝臟造血干細胞和淋巴系祖細胞以及T細胞分化方向的各細胞群的差別。最后,我們通過體外IFN-y直接刺激純化的造血干細胞,來觀測IFN-γ是否直接影響造血干細胞的增殖、凋亡以及向T細胞方向的分化發(fā)育。方法1.分離肝臟、骨髓單個核細胞,或者用流式細胞術(shù)分選出LSK(Lin-Sca-1+c-Kit+)細胞,培養(yǎng)于甲基纖維素半固體培養(yǎng)基中,觀察形成的集落數(shù)及集落大小。2.分離IFN-y缺失鼠、野生鼠的肝臟和骨髓單個核細胞,培養(yǎng)于甲基纖維素半固體培養(yǎng)基中,觀察形成的集落數(shù)及集落大小。3.采用流式細胞術(shù)檢測對比IFN-γ缺失鼠和野生鼠肝臟中各群造血干細胞比例的變化,及其與骨髓中造血干細胞的差別。4.流式細胞術(shù)檢測IFN-y缺失鼠和野生鼠肝臟及骨髓中淋巴系祖細胞、T前體細胞及γδT細胞比例的差別。5.通過尾靜脈高壓注射的方法建立肝臟過表達IFN-y模型。采用流式細胞術(shù)檢測對比肝臟過表達IFN-γ小鼠和野生鼠肝臟及骨髓中各群造血干細胞比例差別。6.流式細胞術(shù)檢測對比體內(nèi)過表達IFN--γ小鼠和野生鼠肝臟及骨髓中淋巴系祖細胞、T前體細胞及γδT細胞比例情況。7.流式細胞術(shù)分選出LSK細胞,與OP9-DL1細胞共培養(yǎng),并加入IFN-γ刺激,流式檢測LSK細胞向T前體細胞分化情況,以及向αβT細胞、γδ T細胞分化情況。8.流式細胞術(shù)分選出LSK細胞,體外IFN-γ刺激培養(yǎng),7-AAD標記凋亡細胞,通過流式檢測細胞凋亡變化。結(jié)果1.IFN-y刺激的肝臟和骨髓單個核細胞、LSK細胞集落形成數(shù)量減少,且形成的集落較小。表明IFN-γ能夠明顯抑制肝臟和骨髓造血干細胞集落形成。2.IFN-γ刺激抑制IFN-γ缺失鼠、野生鼠的肝臟和骨髓單個核細胞集落形成能力,并且IFN-γ缺失鼠肝臟單個核細胞集落形成單位明顯大于野生鼠,而骨髓中差別不明顯。3.缺失IFN-y的小鼠肝臟和骨髓的造血干細胞LSK細胞、具有長期造血能力的干細胞LT-HSC細胞、具有短期造血能力的干細胞ST-HSC細胞以及多潛能造血干細胞MPP細胞比例均增加。4.缺失IFN-γ的小鼠肝臟共同淋巴系祖細胞CLP細胞比例呈增加趨勢。5.缺失IFN-γ的小鼠肝臟T前體細胞群DN1～DN4整體比例增加,而成熟αβT細胞、γδT細胞無明顯變化。6.體內(nèi)過表達IFN-y后小鼠肝臟及骨髓中LSK雖然上升,但是具有長期造血能力的造血干細胞CD48-LSK細胞明顯降低。7.體內(nèi)過表達IFN-y后肝臟共同淋巴系祖細胞CLP細胞增加,而T前體細胞群比例不變,其中DN1比例上調(diào)且DN1細胞增殖能力下降。8.LSK細胞與OP9-DL1細胞共孵育能誘導分化到T前體細胞及分化到成熟的αβT細胞、yδT細胞。并且IFN-y刺激抑制LSK細胞向T前體細胞及γδ T細胞的分化進程。9.IFN-γ刺激后LSK細胞的7-AAD陽性細胞比例很小與未刺激組無差別。結(jié)論1.成年肝臟造血干細胞具有造血功能,且可以向γδT細胞方向發(fā)育分化。2.IFN-γ抑制肝臟和骨髓造血干細胞的集落形成能力,而對肝臟造血干細胞的影響更為明顯。3.IFN-γ抑制肝臟和骨髓造血干細胞由LT-HSC向ST-HSC和MPP發(fā)育分化的進程。4.1FN-γ抑制肝臟和骨髓造血干細胞向淋巴系祖細胞、T前體細胞以及γδT細胞的發(fā)育分化。5.1FN-γ刺激不影響肝臟和骨髓造血干細胞的凋亡。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R392

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本文編號：2395993