【摘要】：人類LMNA基因突變可引起嚴(yán)重的早發(fā)性衰老、肌肉營(yíng)養(yǎng)不良、家族部分性脂肪營(yíng)養(yǎng)不良和心肌病綜合癥等多種疾病,這些疾病統(tǒng)稱為核纖層蛋白病。Lmna基因缺失小鼠具有核纖層蛋白病類似的臨床特征,是研究核纖層蛋白功能及其相關(guān)疾病的一種常用動(dòng)物模型。MicroRNA (miRNA)是一類強(qiáng)大的基因表達(dá)調(diào)節(jié)因子,可通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)參與細(xì)胞內(nèi)多種生理、病理過(guò)程,包括衰老和心肌病等。盡管如此,miRNA在核纖層蛋白病中的表達(dá)、功能尚不完全清楚。本文擬利用Lmna基因缺失小鼠模型篩選差異表達(dá)的miRNA,并進(jìn)一步探討其在核纖層蛋白病中的作用及其潛在分子機(jī)制。第一部分miR-107在Lmna-/-小鼠MEFs及各組織中的表達(dá)目的驗(yàn)證前期通過(guò)Illumina Next Gen Sequencing方法篩選的在Lmna缺失和野生型C57BL/6小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEFs)中差異表達(dá)的miRNA并探討其功能。方法應(yīng)用real time PCR技術(shù)驗(yàn)證在測(cè)序結(jié)果中差異表達(dá)的miRNA(如mmu-miR-1、miR-107、miR-671-5p等)；選取差異較大的miR-107,檢測(cè)其在Lmna-/-和Lmna+/+ C57BL/6小鼠不同組織中的表達(dá)。結(jié)果miR-107在Lmna-/-小鼠MEFs中的表達(dá)水平顯著低于Lmna+/+ MEFs,下調(diào)約52.1%(P0.05)；同時(shí), Lmna-/-小鼠肝臟、心臟和肺組織中miR-107的表達(dá)均低于Lmna+/+小鼠(P0.05)。結(jié)論與野生型C57BL/6小鼠相比,miR-107在Lmna-/-小鼠MEFs及心、肝、肺組織中呈顯著低水平表達(dá)。第二部分miR-107及其靶基因CAVl參與調(diào)控Lmna-/- MEFs的衰老目的探討miR-107與已知靶基因CAV1在Lmna缺失和野生型小鼠胚胎成纖維細(xì)胞衰老中的作用。方法分別在Lmna-/-和Lmna+/+ MEFs中過(guò)表達(dá)或沉默miR-107的表達(dá),檢測(cè)衰老相關(guān)p-半乳糖苷酶的活性及靶基因CAV1的表達(dá)變化。結(jié)果Lmna-/- MEFs中Cavl的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著增高,約為L(zhǎng)mna+/+ MEFs中Cav1 mRNA表達(dá)的1.7倍(P0.05)。Lmna-/- MEFs (P4)中轉(zhuǎn)染miR-107的模擬物mimics,可顯著抑制CAV1的表達(dá),p-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性細(xì)胞百分率減少約8%(P0.05)；而在Lmna+/+ MEFs (P4)中下調(diào)miR-107,可上調(diào)CAV1的表達(dá),p-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性細(xì)胞百分率增加約為10%(P0.05)。結(jié)論Lmna-/- MEFs中Cavl的表達(dá)水平顯著高于Lmna+/+MEFs,miR-107可能通過(guò)調(diào)節(jié)CAVl的表達(dá)水平,參與調(diào)控MEFs的衰老。第三部分miR-107靶基因Cacna2d1的驗(yàn)證及結(jié)合位點(diǎn)研究目的 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)并實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證mmu-miR-107的靶基因Cacna2dl。方法利用TargetScan、miRanda、Clip-seq及miRDB預(yù)測(cè)其靶基因,分別構(gòu)建含有候選靶基因(Cacna2dl、Capza2、Celsr2、 Csnklg2和jmem47) 3'UTR的熒光素酶報(bào)告載體pGL3,并用重疊延伸PCR技術(shù)分別構(gòu)建含有Cacna2dl基因結(jié)合miR-107位點(diǎn)的3'UTR單個(gè)突變位點(diǎn)的載體Mut1200-207、Mut2361-367、Mut3902-908和同時(shí)含有3個(gè)突變結(jié)合位點(diǎn)的載體Mut4plus。將各重組質(zhì)粒與miRNA mimics共轉(zhuǎn)染C2C 12細(xì)胞,檢測(cè)熒光素酶活性。實(shí)時(shí)定量PCR和免疫印跡法進(jìn)一步驗(yàn)證miR-107對(duì)靶基因Cacna2dl的調(diào)控作用。結(jié)果 成功構(gòu)建分別含有5個(gè)候選靶基因3'UTR的熒光素酶報(bào)告載體和Cacna2dl的4個(gè)突變質(zhì)粒；與共轉(zhuǎn)染候選基因3'UTR質(zhì)粒和miR-NC組相比,共轉(zhuǎn)染pGL3-Cacna2dl 3'UTR及]miR-107 mimics組C2C12細(xì)胞熒光素酶活性下降33.4%(P0.01)；且與共轉(zhuǎn)染對(duì)應(yīng)的突變體和miR-NC組相比,轉(zhuǎn)染突變體Mut2361-367/Mut3902-908和miR-107]mimics組的熒光素酶活性均下降(P0.05)；轉(zhuǎn)染突變體Mut1200-207/Mut4plus和miR-107 mimics組的熒光素酶活性下降不明顯(P0.05)。其余候選靶基因Capza2、Celsr2、Csnklg2和Tmem47的共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。過(guò)表達(dá)或下調(diào)C2C12細(xì)胞的miR-107,可有效降低或提高Cacna2dl的mRNA表達(dá)水平(P0.05),且過(guò)表達(dá)miR-107可抑制Cacna2dl的蛋白表達(dá)(P0.05)。結(jié)論 初步驗(yàn)證Cacna2dl是mmu-miR-107的靶基因,且結(jié)合位點(diǎn)為Cacna2dl 3'UTR的200-207。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R363

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本文編號(hào)：2378488