【摘要】：腺病毒載體在基因治療和重組疫苗研究中有著廣泛的應(yīng)用。腺病毒是無包膜的雙鏈DNA病毒,人腺病毒(human adenovirus, HAdV)共有50多個(gè)血清型,分為A-G共7個(gè)組(種),它們對(duì)機(jī)體的感染部位和引發(fā)的疾病類型各不相同。最常用的腺病毒載體是基于HAdV5構(gòu)建的,HAdV5屬于HAdV-C,主要感染上呼吸道,靶細(xì)胞是呼吸道上皮細(xì)胞,細(xì)胞表面的病毒受體是CAR。本實(shí)驗(yàn)室建立了HAdV41載體系統(tǒng)。HAdV41屬于HAdV-F,被稱為腸腺病毒,能引起腹瀉,是天然的腸道病原；HAdV41的靶細(xì)胞可能是腸道上皮細(xì)胞,它的細(xì)胞受體還沒有完全闡明。HAdV5與HAdV41的生物學(xué)特性存在較大差異,以它們?yōu)檩d體的重組疫苗在宿主引發(fā)的免疫反應(yīng)可能不同。中東呼吸道綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV)初次發(fā)現(xiàn)于2012年,是一種可引起類似于急性呼吸道綜合征(SARS)疾病并有高致死率的新發(fā)人類冠狀病毒。MERS-CoV已成為巨大的公共健康威脅,但目前還沒有有效的疫苗或治療方案來應(yīng)對(duì)可能的MERS-CoV爆發(fā)。冠狀病毒的刺突(spike, S)糖蛋白是病毒粒子外膜的特征性結(jié)構(gòu)組分,在病毒吸附和進(jìn)入靶細(xì)胞時(shí)發(fā)揮重要作用,是冠狀病毒的主要中和抗原。本研究設(shè)計(jì)并構(gòu)建了表達(dá)MERS-CoV S蛋白的重組HAdV41 (rHAdV41)和重組HAdV5 (rHAdV5),采用灌胃和肌肉注射的免疫方式,在小鼠模型觀察了細(xì)胞免疫和體液免疫效果。并構(gòu)建了共表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)和螢火蟲熒光素酶(firefly luciferase)報(bào)告基因的重組腺病毒,利用活體成像技術(shù)和體外組織熒光素酶(luciferase)活力檢測兩種方法,檢測了不同感染途徑,在不同時(shí)間點(diǎn),外源基因在小鼠體內(nèi)各種組織的表達(dá)情況。1.疫苗載體在小鼠模型的免疫效果評(píng)價(jià)目的構(gòu)建MERS-CoV重組腺病毒疫苗,并觀察其在小鼠模型的免疫效果,為控制MERS-CoV的感染和傳播探索可能的疫苗方案。方法在課題組已有研究基礎(chǔ)上,將MERS-CoV S基因插入腺病毒E1缺失區(qū),構(gòu)建可以表達(dá)MERS-CoVS蛋白的rHAdV41和rHAdV5(HAdV41-MERS-S和HAdV5-MERS-S),分別利用已有的包裝細(xì)胞系293TE32細(xì)胞和293細(xì)胞進(jìn)行拯救并擴(kuò)增。同時(shí)構(gòu)建了攜帶GFP基因的2種對(duì)照病毒HAdV41-GFP和HAdV5-GFP。Hirt法提取重組腺病毒基因組,通過酶切、PCR進(jìn)行鑒定；Western blot和間接免疫熒光法(IFA)鑒定重組腺病毒感染細(xì)胞后外源蛋白MERS-CoV S蛋白的表達(dá)。擴(kuò)增重組腺病毒,采用CsCl密度梯度超速離心純化,采用消化法測定病毒顆粒數(shù)滴度,再通過有限稀釋法測定其感染滴度。HAdV41-MERS-S以5×10.vp(viral particle)每只為免疫劑量,HAdV5-MERS-S以1×109Vp每只為免疫劑量,采用肌肉注射(i.m.)100μl每只、灌胃(i.g.)500μl每只兩種給藥途徑免疫小鼠,4周后,處死半數(shù)小鼠,取血清測定IgG.IgA和中和抗體,血清、肺灌洗液、小腸、大腸測定IgA,脾和肺淋巴細(xì)胞測定細(xì)胞因子；16周后處死余下半數(shù)小鼠,同樣對(duì)體液免疫和細(xì)胞免疫效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果成功進(jìn)行了腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建和重組病毒的拯救。Hirt法提取重組腺病毒基因組后,酶切鑒定和PCR擴(kuò)增目標(biāo)序列的結(jié)果與預(yù)期一致;Western blot和間接免疫熒光檢測結(jié)果顯示,所得到的重組腺病毒可以表達(dá)MERS-CoV S蛋白。擴(kuò)增純化后得到2.3 ml HAdV41-MERS-S,其顆粒滴度為5.71×1011vp/ml,感染滴度為2.7×10.IU/ml(infectious unit per milliliter)；得到2.3 ml HAdV5-MERS-S,其顆粒滴度為3.57×1012 vp/ml感染滴度為1.3×1011IU/ml.同時(shí)成功制備純化了對(duì)照病毒。經(jīng)肌肉注射免疫小鼠,免疫4周后,實(shí)驗(yàn)組每組(n=5)100%小鼠體內(nèi)都產(chǎn)生了MERS-S特異性的IgG抗體；用HAdV41-MERS-S免疫鼠有20%體內(nèi)產(chǎn)生了MERS-S特異性的中和抗體,用HAdV5-MERS-S免疫,小鼠體內(nèi)中和抗體檢出率為100%；各組小鼠體內(nèi)IgA抗體均未檢測到；但脾細(xì)胞和肺淋巴結(jié)都可檢測到抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答。肌注免疫16周后,實(shí)驗(yàn)組抗原特異的IgG抗體、中和抗體和T細(xì)胞應(yīng)答仍可檢測到。經(jīng)灌胃途徑免疫,4周后,2種病毒載體實(shí)驗(yàn)組均有60%小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了MERS-S特異性的IgG抗體(n=5)；HAdV41-MERS-S免疫組,有40%小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了MERS-S特異性的中和抗體,HAdV5-MERS-S免疫組小鼠體內(nèi)中和抗體檢出率為60%；實(shí)驗(yàn)組血清、肺灌洗液、小腸和大腸都可以檢測到抗原特異的IgA抗體,但抗原特異的T細(xì)胞應(yīng)答未檢出；16周后,實(shí)驗(yàn)組抗原特異的IgG、IgA和中和抗體仍可檢測到。結(jié)論采用肌肉注射免疫途徑,HAdV41-MERS-S和HAdV5-MERS-S單次免疫即可激發(fā)脾細(xì)胞和肺淋巴結(jié)的抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答,且可持續(xù)數(shù)月,但I(xiàn)gA抗體并未檢測到。采用灌胃免疫途徑,HAdV41-MERS-S和HAdV5-MERS-S都可產(chǎn)生抗原特異的IgA抗體,在血清和多種粘膜表面均有檢出；但抗原特異的T細(xì)胞應(yīng)答未檢測到。肌注和灌胃兩種免疫途徑均可有效激發(fā)小鼠產(chǎn)生IgG抗體和中和抗體。2.疫苗載體在小鼠模型的體內(nèi)分布目的觀察重組腺病毒HAdV41和HAdV5在小鼠模型的體內(nèi)分布,為疫苗載體的安全性評(píng)價(jià)提供參考。方法分別以pLEGFP-C1和pGL4.17質(zhì)粒為模板,用PCR擴(kuò)增綠色熒光蛋白(GFP)和螢火蟲熒光素酶(firefly luciferase)報(bào)告基因,酶切后與空穿梭質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物連接,構(gòu)建攜帶目的基因的穿梭質(zhì)粒psh41GFP-T2A-Luc和psh5GFP-T2A-Luc。含目的基因的穿梭質(zhì)粒經(jīng)酶切、PCR和測序鑒定后,與骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài)細(xì)胞,構(gòu)建共表達(dá)GFP和firefly luciferase報(bào)告基因的重組腺病毒質(zhì)粒pAdV41GFP-T2A-Luc和pAdV5GFP-T2A-Luc。用lipofectamine 2000分別轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系293TE32細(xì)胞和293細(xì)胞,進(jìn)行拯救和擴(kuò)增,得到重組腺病毒HAdV41GFP-T2A-Luc和HAdV5GFP-T2A-Luc。Hirt法提取重組腺病毒基因組,限制性酶切和PCR進(jìn)行鑒定；蛋白水平上,用重組腺病毒感染A549細(xì)胞,通過觀察熒光和luciferase assay檢測GFP和熒光素酶的表達(dá)。擴(kuò)增的重組腺病毒采用CsCl密度梯度進(jìn)行純化,消化法測定病毒顆粒數(shù)滴度,有限稀釋法測定感染滴度。HAdV41GFP-T2A-Luc和HAdV5 GFP-T2A-Luc分別以5×109Vp和1x109vp每只的感染劑量,采用肌肉注射(100μl每只)或灌胃(500μl每只)兩種給藥途徑感染小鼠。在感染后4h、18 h、48 h、7d,利用活體成像技術(shù)進(jìn)行活體觀察熒光素酶的表達(dá)；在對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)每組處死2只小鼠,取17種共19樣組織,提取活性蛋白后,用luciferase assay試劑盒檢測熒光素酶在不同組織的分布。結(jié)果成功構(gòu)建了重組腺病毒質(zhì)粒并拯救出相應(yīng)的重組病毒,在病毒基因組水平,限制性酶切和PCR鑒定結(jié)果與預(yù)期一致。感染A549后,熒光觀察和luciferase活力測定結(jié)果顯示重組病毒表達(dá)GFP和熒光素酶。擴(kuò)增純化后,得到1.65ml HAdV41GFP-T2A-Luc,顆粒滴度為7.6×1010vp/ml,感染滴度為2.9×108 IU/ml;得到2.11ml HAdV5GFP-T2A-Luc,顆粒滴度為4.2×1011vp/ml,感染滴度為3.1×1010 IU/ml。2種病毒經(jīng)肌肉注射途徑感染,活體成像和體外酶活測定的結(jié)果均表明病毒主要分布在注射部位,目的基因表達(dá)強(qiáng),在肝和脾報(bào)告基因表達(dá)較弱檢出,隨著時(shí)間延長逐漸減弱。HAdV41GFP-T2A-Luc經(jīng)灌胃途徑感染小鼠,活體成像結(jié)果表明,僅在感染后18h,小鼠口鼻部可見較弱熒光,其他時(shí)間點(diǎn)或在其他部位未檢測到；體外組織檢測結(jié)果表明,在感染后4h和18h,在消化道(派氏結(jié)、小腸下段、大腸)可以檢測到較弱的luciferase表達(dá)。HAdV5GFP-T2A-Luc經(jīng)灌胃途徑感染小鼠,活體成像結(jié)果表明,在感染后18h和48h,小鼠口鼻部可見較弱熒光；體外組織檢測結(jié)果表明,在消化道(派氏結(jié)、小腸下段、大腸)、氣管和肺可以檢測到較弱的luciferase表達(dá)。結(jié)論在小鼠體內(nèi),HAdV41和HAdV5經(jīng)肌注途徑感染,主要分布在注射部位,少量分布在肝和脾；經(jīng)灌胃途徑感染,目的基因表達(dá)較弱,主要分布在消化道。總之,我們成功構(gòu)建了攜帶MERS-CoV S基因的重組HAdV41和HAdV5,單次免疫小鼠,能夠激發(fā)小鼠產(chǎn)生相應(yīng)的體液免疫和細(xì)胞免疫；利用報(bào)告基因系統(tǒng),觀察了重組病毒感染后在小鼠體內(nèi)的分布情況,部分解釋了重組疫苗灌胃給藥后機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)較弱的原因。本研究為MERS-CoV疫苗研發(fā)進(jìn)行了有益的探索；首次觀察了重組HAdV41灌胃后目的基因在小鼠體內(nèi)的表達(dá)分布,豐富了HAdV41病毒學(xué)的內(nèi)容,為HAdV41載體進(jìn)一步開發(fā)利用打下了基礎(chǔ)。研究結(jié)果同時(shí)提示小鼠不是理想的研究HAdV41口服感染的動(dòng)物模型。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392

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