發(fā)布時間：2018-11-28 13:20

【摘要】：免疫球蛋白M（IgM）是人的免疫球蛋白之一，根據(jù)結(jié)構(gòu)的不同將免疫球蛋白分為五種，其他還有l(wèi)gA、lgG、IgD和lgE。IgM占血清免疫球蛋白總量的5%-10%，是分子量最大的Ig，一般不能通過血管壁，主要存在于血液中。IgM也是初次體液免疫應(yīng)答中最早出現(xiàn)的抗體，是機體抗感染的“先頭部隊”，血清中檢出IgM提示新近發(fā)生感染，可用于感染的早期診斷。在感染過程中IgM首先出現(xiàn)，但持續(xù)時間不長，是近期感染的標(biāo)志。 IgM分子包括重鏈μ鏈和輕鏈λ，輕鏈?zhǔn)歉黝惷庖咔虻鞍坠灿�，重鏈μ鏈�(zhǔn)荌gM分子所特有的，已有研究表明抗人IgMμ鏈單克隆抗體可用于多種感染性疾病的早期診斷以及免疫學(xué)的研究。但是用于制備抗人IgMμ鏈單克隆抗體的天然的IgMμ鏈來源少，制備方法繁瑣，價格較高，而且IgMμ鏈本身易降解。因此，本研究利用基因工程技術(shù)，通過重組構(gòu)建、原核表達(dá)IgMμ鏈恒定區(qū)各肽段，并對其免疫原性進(jìn)行檢測，以期得到免疫原性同天然IgMμ鏈相近的肽段，能夠進(jìn)一步用于制備抗人IgMμ鏈單克隆抗體。 本研究分為一下兩個部分：第一部分基因合成以及原核表達(dá)IgMμ鏈恒定區(qū)各肽段 分析IgM的結(jié)構(gòu)，IgM的重鏈有一個可變區(qū)（VH）和四個恒定區(qū)（CHl、CH2、CH3和CH4）共五個功能區(qū)。VL和VH是與抗原結(jié)合的部位，單體由一對L鏈和一對H鏈組成的基本結(jié)構(gòu)，有2個與抗原結(jié)合的位點，共分為可變區(qū)和恒定區(qū)，H和L鏈上都有可變區(qū)，同類重鏈和同型輕鏈的近N端約110個氨基酸序列的變化很大，其他部分的氨基酸序列相對恒定，據(jù)此可將輕鏈和重鏈區(qū)分為可變區(qū)（V）和恒定區(qū)（C）。IgM分子包括重鏈μ鏈和輕鏈λ，輕鏈?zhǔn)歉黝惷庖咔虻鞍坠灿校劓湨替準(zhǔn)荌gM分子所特有。 通過GenBank數(shù)據(jù)庫查詢的到人IgMμ鏈恒定區(qū)完整的氨基酸序列，根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫IgMμ鏈恒定區(qū)（CH1-CH4）的cDNA序列并進(jìn)行必要的大腸桿菌密碼子優(yōu)化，本研究構(gòu)建了并原核表達(dá)了IgMμ鏈恒定區(qū)3個肽段。具體方法如下：分別獲得IgMμ鏈（CH1-CH4）、 IgMμ鏈（CH1-CH2）、 IgMμ鏈（CH3-CH4）基因片段，利用重疊延伸PCR (Overlap Extension Ploymerase Chain Reaction，OE-PCR)體外基因合成人IgMμ鏈恒定區(qū)全長（CH1-CH4）及其截斷片段CH1-CH2和CH3-CH4。用T/A克隆法將各片段克隆至pMD18-T載體進(jìn)行測序。將測序正確的序列分別克隆到原核表達(dá)載體pPET-32a，構(gòu)建其原核表達(dá)質(zhì)粒：PET32a-rMμCH1-CH4， PET32a-rMμCH1-CH2和PET32a-rMμCH3-CH4，將上述原核表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入E. coli BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，獲得3種截短的IgMμ鏈恒定區(qū)融合蛋白ET32a-rMμCH1-CH4， PET32a-rMμCH1-CH2和PET32a-rMμCH3-CH4，其相對分子量分別約為：69.8KD、43.8KD、46.9KD并用Ni-NTA親和層析法純化目的融合蛋白。通過12%SDS-PAGE電泳分析，分別可見分子量約為69.8KD、43.8KD、46.9KD左右的特異的條帶，大小與理論值相符。表明本研究成功構(gòu)建并表達(dá)出PET32a-rMμCH1-CH4，PET32a-rMμCH1-CH2和PET32a-rMμCH3-CH4融合蛋白。第二部分重組蛋白免疫原性分析及與天然人IgM、 IgMμ鏈和IgG比較 用PET32a-rMμCH1-CH4，PET32a-rMμCH1-CH2和PET32a-rMμCH3-CH4融合蛋白分別免疫BALB/c小鼠，制備小鼠抗血清，用以觀察誘導(dǎo)產(chǎn)生針對IgMμ鏈的特異性抗體情況；用天然的人IgM、 IgMμ鏈和IgG免疫BALB/c小鼠，制備小鼠抗血清，以檢測融合蛋白PET32a-rMμCH1-CH4， PET32a-rMμCH1-CH2和PET32a-rMμCH3-CH4誘導(dǎo)產(chǎn)生產(chǎn)生針對IgMμ鏈的特異性抗體于天然IgM、IgMμ鏈之間的差異，以及天然的人IgM、 IgMμ鏈和IgG之間交叉反應(yīng)性。 ELISA檢測結(jié)果顯示，上述PET32a-rMμCH1-CH4， PET32a-rMμCH1-CH2和PET32a-rMμCH3-CH4融合蛋白均可以與天然的IgM、 IgMμ鏈特異性反應(yīng)，表明重組蛋白具有與天然IgMμ鏈的反應(yīng)能力，保留了IgMμ鏈的免疫原性。然而，重組蛋白的免疫原性較天然的IgMμ鏈稍弱，誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體滴度稍偏低，（取對數(shù)后抗體滴度為3.2-2），而天然的IgMμ鏈誘導(dǎo)產(chǎn)生較高的抗體滴度（取對數(shù)后抗體滴度為4.5），，提示截斷表達(dá)IgMμ鏈可能對其免疫原性產(chǎn)生影響。其次天然的人IgM、 IgMμ鏈和IgG免疫產(chǎn)生的抗血清，IgM免疫的血清與IgG有較強的交叉反應(yīng)性，同樣IgG免疫的血清與IgM也存在較強的交叉反應(yīng)性；與IgM不一樣的IgMμ免疫的血清與IgG交叉反應(yīng)弱。 總結(jié)： 1.本研究成功構(gòu)建3種IgMμ鏈重組肽段的原核表達(dá)質(zhì)粒并經(jīng)E.coli表達(dá)，獲得了3種截短的IgMμ鏈3個肽段的重組蛋白。 2.所構(gòu)建的3種蛋白PET32a-rMμCH1-CH4，PET32a-rMμCH1-CH2和PET32a-rMμCH3-CH4均較好的保留了IgMμ鏈的免疫原性，誘導(dǎo)出較高滴度的針對IgMμ鏈的特異性抗體，提示重組的3各肽可能可以代替天然的IgMμ鏈，成為制備抗IgMμ鏈單克隆抗體的原料。為利用基因工程探尋天然IgMμ鏈的代替品奠定了基礎(chǔ)。 3.用天然的人IgM、IgMμ鏈和IgG免疫BALB/c小鼠，制備小鼠抗血清，IgM免疫的血清與IgG有較強的交叉反應(yīng)性，IgG免疫的血清與IgM也存在較強的交叉反應(yīng)性；與IgM不一樣的IgMμ鏈免疫的血清與IgG交叉反應(yīng)弱。而重組的PET32a-rMμCH1-CH4，PET32a-rMμCH1-CH2和PET32a-rMμCH3-CH4融合蛋白與IgG無明顯的交叉反應(yīng)，提示抗IgMμ鏈的單克隆抗體比抗IgM的單克隆抗體更具特異性，在臨床感染性疾病的早期診斷和免疫學(xué)的研究就中更加的精確，重組的PET32a-rMμCH1-CH4, PET32a-rMμCH1-CH2和PET32a-rMμCH3-CH4融合蛋白較好的保留了IgMμ鏈這一特征，初步的研究結(jié)果為進(jìn)一步的分析和篩選臨床用于檢測和基礎(chǔ)研究的單克隆抗體提供了一定的實驗依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R73-3

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 葉嗣穎;抑制性T細(xì)胞因子抗原結(jié)合鏈的恒定區(qū)決定簇[J];國外醫(yī)學(xué)(免疫學(xué)分冊);1983年03期

2 唐昊;修清玉;陸慧琦;韓煥興;;人IgE重鏈恒定區(qū)CH_4亞基的克隆、原核表達(dá)及純化[J];免疫學(xué)雜志;2008年02期

3 唐昊;陸慧琦;韓煥興;修清玉;;中國漢族人IgE重鏈恒定區(qū)CH_2-CH_4cDNA的克隆[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2006年10期

4 朱炳法;帶γδ受體T細(xì)胞的功能及其特異性[J];國外醫(yī)學(xué)(免疫學(xué)分冊);1990年01期

5 王景鋒;邵軍軍;李菁;高閃電;獨軍政;叢國正;林彤;常惠蕓;;Asia I型口蹄疫病毒中和表位與羊IgG重鏈恒定區(qū)的融合表達(dá)及免疫原性測定[J];生物工程學(xué)報;2010年04期

6 ;最新專利文摘[J];生物加工過程;2005年01期

7 黃健;芝口浩智;黑木政秀;;抗CEA抗體C2-45重鏈恒定區(qū)的置換與活性鑒定[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2006年05期

8 唐昊;修清玉;陸慧琦;韓煥興;;中國漢族人IgE重鏈恒定區(qū)CH_2、CH_3及CH_4亞基cDNA的克隆[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2007年10期

9 姚宏震;;β_2微球旦白——基礎(chǔ)與臨床(綜述)[J];錦州醫(yī)學(xué)院學(xué)報;1981年02期

10 陳麗華,金伯泉;免疫球蛋白超家族分子在神經(jīng)系統(tǒng)中的分布及功能[J];細(xì)胞生物學(xué)雜志;2000年02期

相關(guān)會議論文 前2條

1 李少兵;余莉;張曉明;蘇彥艷;;原鈣粘蛋白α“恒定區(qū)”胞內(nèi)域與鈉鉀ATP酶β1亞單位的特異性識別結(jié)合研究[A];中國解剖學(xué)會2013年年會論文文摘匯編[C];2013年

2 唐昊;陸慧琦;修清玉;韓煥興;;人IgE重鏈恒定區(qū)CH_2-CH_4cDHA的克隆及序列測定[A];中華醫(yī)學(xué)會第七次全國呼吸病學(xué)術(shù)會議暨學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2006年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 張婧;人IgMμ鏈恒定區(qū)各肽段的基因合成原核表達(dá)及免疫原性分析[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2013年

2 盛巧玲;鵝IgA重鏈恒定區(qū)的原核表達(dá)和特異性抗體的制備與鑒定[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

本文編號：2362933