【摘要】：目的構建CD45RO不同N-糖基化位點突變的T細胞株,并檢測其與galectin-3的結合情況。方法采用N→Q定點突變技術分別去除CD45RO的11個N-糖基化位點,制備單個N-糖基化位點缺失的CD45RO,然后將其導入慢病毒表達載體pWPXL中,11個攜帶單個N-糖基化位點缺失的CD45RO重組慢病毒質粒與慢病毒包裝質粒psPAX2和MD2.G共轉染293T細胞,將包裝重組慢病毒感染CD45-的J45.01細胞,流式分選后獲得11株分別表達CD45RO單個N-糖基化位點缺失的J45.01 T細胞株。通過RT-PCR和流式細胞術分別從RNA水平和蛋白水平驗證CD45RO突變體的轉錄和表達,應用流式細胞術檢測CD45RO突變細胞株與galectin-3的結合情況。結果成功構建了11個CD45RO單個N-糖基化位點缺失的T細胞株,各突變細胞株能穩(wěn)定表達突變基因,經(jīng)測序再次證實突變位點正確,CD45RO突變體能穩(wěn)定表達于細胞表面。galectin-3與N327Q突變細胞的結合明顯增強,與N36Q突變細胞和N217Q突變細胞的結合明顯減弱。結論 CD45RO N-糖基化位點對galectin-3與CD45RO-J45.01細胞的結合有調(diào)節(jié)作用。
[Abstract]:Aim to construct T cell lines with different N-glycosylation sites of CD45RO and to detect their binding to galectin-3. Methods 11 N-glycosylation sites of CD45RO were removed by N Q site-directed mutagenesis, and a single CD45RO, with missing N-glycosylation sites was prepared and then introduced into lentivirus expression vector pWPXL. Eleven CD45RO recombinant lentivirus plasmids carrying a single N-glycosylation site deletion were co-transfected with lentivirus packaging plasmids psPAX2 and MD2.G into 293T cells. J45.01 cells infected with CD45- were infected with the recombinant lentivirus. After flow sorting, 11 J45.01 T cell lines expressing CD45RO single N-glycosylation site deletion were obtained. The transcription and expression of CD45RO mutants were verified by RT-PCR and flow cytometry from RNA level and protein level respectively. The binding of CD45RO mutant cell line to galectin-3 was detected by flow cytometry. Results A total of 11 T cell lines with single N-glycosylation site deletion in CD45RO were successfully constructed. The mutant genes were stably expressed in each mutant cell line, and the mutation sites were confirmed to be correct by sequencing. The binding of galectin-3 to N327Q mutant cells was significantly enhanced, while the binding to N36Q mutant cells and N217Q mutant cells was weakened. Conclusion CD45RO N-glycosylation sites can regulate the binding of galectin-3 to CD45RO-J45.01 cells.
【作者單位】： 北京協(xié)和醫(yī)學院中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室;
【基金】：北京協(xié)和醫(yī)學院協(xié)和青年科研基金(2012J24) 中央高�；究蒲袠I(yè)務費專項資金(DWS201208)
【分類號】：R392.1

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