發(fā)布時(shí)間：2018-11-29 07:43

【摘要】：目的構(gòu)建CD45RO不同N-糖基化位點(diǎn)突變的T細(xì)胞株,并檢測其與galectin-3的結(jié)合情況。方法采用N→Q定點(diǎn)突變技術(shù)分別去除CD45RO的11個(gè)N-糖基化位點(diǎn),制備單個(gè)N-糖基化位點(diǎn)缺失的CD45RO,然后將其導(dǎo)入慢病毒表達(dá)載體pWPXL中,11個(gè)攜帶單個(gè)N-糖基化位點(diǎn)缺失的CD45RO重組慢病毒質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒psPAX2和MD2.G共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,將包裝重組慢病毒感染CD45-的J45.01細(xì)胞,流式分選后獲得11株分別表達(dá)CD45RO單個(gè)N-糖基化位點(diǎn)缺失的J45.01 T細(xì)胞株。通過RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)分別從RNA水平和蛋白水平驗(yàn)證CD45RO突變體的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD45RO突變細(xì)胞株與galectin-3的結(jié)合情況。結(jié)果成功構(gòu)建了11個(gè)CD45RO單個(gè)N-糖基化位點(diǎn)缺失的T細(xì)胞株,各突變細(xì)胞株能穩(wěn)定表達(dá)突變基因,經(jīng)測序再次證實(shí)突變位點(diǎn)正確,CD45RO突變體能穩(wěn)定表達(dá)于細(xì)胞表面。galectin-3與N327Q突變細(xì)胞的結(jié)合明顯增強(qiáng),與N36Q突變細(xì)胞和N217Q突變細(xì)胞的結(jié)合明顯減弱。結(jié)論 CD45RO N-糖基化位點(diǎn)對(duì)galectin-3與CD45RO-J45.01細(xì)胞的結(jié)合有調(diào)節(jié)作用。
[Abstract]:Aim to construct T cell lines with different N-glycosylation sites of CD45RO and to detect their binding to galectin-3. Methods 11 N-glycosylation sites of CD45RO were removed by N Q site-directed mutagenesis, and a single CD45RO, with missing N-glycosylation sites was prepared and then introduced into lentivirus expression vector pWPXL. Eleven CD45RO recombinant lentivirus plasmids carrying a single N-glycosylation site deletion were co-transfected with lentivirus packaging plasmids psPAX2 and MD2.G into 293T cells. J45.01 cells infected with CD45- were infected with the recombinant lentivirus. After flow sorting, 11 J45.01 T cell lines expressing CD45RO single N-glycosylation site deletion were obtained. The transcription and expression of CD45RO mutants were verified by RT-PCR and flow cytometry from RNA level and protein level respectively. The binding of CD45RO mutant cell line to galectin-3 was detected by flow cytometry. Results A total of 11 T cell lines with single N-glycosylation site deletion in CD45RO were successfully constructed. The mutant genes were stably expressed in each mutant cell line, and the mutation sites were confirmed to be correct by sequencing. The binding of galectin-3 to N327Q mutant cells was significantly enhanced, while the binding to N36Q mutant cells and N217Q mutant cells was weakened. Conclusion CD45RO N-glycosylation sites can regulate the binding of galectin-3 to CD45RO-J45.01 cells.
【作者單位】： 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院協(xié)和青年科研基金(2012J24) 中央高�；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(DWS201208)
【分類號(hào)】：R392.1

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