【摘要】：河弧菌(Vibrio fluvialis)作為一種新近出現(xiàn)的食源性病原菌,正在逐漸成為一個(gè)新的公共衛(wèi)生問題。河弧菌能夠引起急性腹瀉的散發(fā)和暴發(fā),偶爾也會(huì)有腸道外感染病例的報(bào)道。河弧菌感染的臨床癥狀與霍亂有些相似,能夠引起病人的水樣腹瀉。目前,對(duì)于河弧菌的生存特點(diǎn)與治病機(jī)制的了解,仍然很有限。Ⅵ型分泌系統(tǒng)(T6SSs)是一種新近發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌分泌系統(tǒng),在很多革蘭陰性菌中均有被發(fā)現(xiàn)。T6SSs常常被認(rèn)為與細(xì)菌的致病力有關(guān),其機(jī)制是通過將毒力蛋白注射到宿主細(xì)胞或外環(huán)境的與其競爭的其他細(xì)菌中,引起靶細(xì)胞的死亡,從而獲得競爭優(yōu)勢(shì)。在本次研究中,我們根據(jù)之前的研究和全基因組測(cè)序結(jié)果,還有PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,明確了 VF85003的兩個(gè)T6SS基因簇(VflT6SS1和VflT6SS2)詳細(xì)的基因、組成結(jié)構(gòu)及其側(cè)翼區(qū)序列,同時(shí)也鑒定出了三個(gè)“獨(dú)立”的hcp-vgrG同源基因簇。我們選擇了 34株野生河弧菌分離株,依據(jù)85003基因組中VflT6SS1和VflT6SS2基因簇,使用疊瓦片式的方式設(shè)計(jì)引物,利用PCR擴(kuò)增野生河弧菌中的T6SS基因簇。結(jié)果顯示VflT6SS2內(nèi)各基因片段的檢出率高于VflT6SS1,提示在野生河弧菌中,VflT6SS2基因簇的分布可能比VflT6SS1更廣泛。在PCR驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中,在某幾個(gè)野生株里,VflT6SS2的tssG2-tagH2、tssJ2-tssK2、或vasI-tssA2,或vasH-vasI、vasI-tssa2或tssM2-vasL并未被檢出,可能是由于各野生株間遺傳背景有差異或基因有突變等原因。Hcp和VgrG既是T6SS的結(jié)構(gòu)蛋白,也能夠作為效應(yīng)子被分泌出去。通過檢測(cè)Hcp蛋白的分泌來判斷T6SS是否有功能活性,是一種常用的T6SS研究方法。在本次研究中,我們發(fā)現(xiàn),VflT6SS2_Hcp的表達(dá)是受溫度影響的。在常規(guī)培養(yǎng)條件下,VflT6SS2在25℃和30℃有組成型表達(dá),在高溫(37℃)下沒有表達(dá)活性,這提示VflT6SS2可能對(duì)于細(xì)菌在水生環(huán)境中的生存具有重要意義。我們收集了 OD600值在0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.8和過夜的菌液,結(jié)果顯示Hcp蛋白在過夜前的菌液中均有表達(dá),但只在OD600為1.0-2.0這一階段能夠分泌出去,說明VflT6SS2_Hcp的分泌也呈生長階段依賴性的。我們?cè)诓煌暮踊【吧曛袡z測(cè)了 VflT6SS2_Hcp的表達(dá)和分泌,結(jié)果顯示,在常規(guī)培養(yǎng)條件下,除了 VF42沒有分泌Hcp蛋白,其他野生株均表現(xiàn)出VflT6SS2的活性。我們的研究發(fā)現(xiàn)增加鹽濃度(NaCl的濃度從170 mM到855 mM)或者使用高的等滲透壓KC1溶液、蔗糖溶液、海藻糖溶液或甘露醇溶液(相當(dāng)于340mM的NaCl溶液)在常規(guī)培養(yǎng)條件下,能夠很明顯的刺激Hcp的分泌,這表明滲透壓也能夠調(diào)控VflT6SS2的功能。而且,我們發(fā)現(xiàn)盡管VflT6SS2在37℃、常規(guī)培養(yǎng)條件下是沒有活性的,但如果使用高鹽濃度(513 mM到855 mM的NaCl),還是能夠激活VflT6SS2,這一結(jié)果也提示了 VflT6SS2可能在感染宿主內(nèi)的特定條件下是能夠發(fā)揮功能的。最后,我們的殺菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示VflT6SS2的功能性表達(dá)與抗菌活性有關(guān)。vasH作為T6SS的全局調(diào)控子,它的缺失能夠影響Hcp的表達(dá)與分泌,進(jìn)而影響VflT6SS2介導(dǎo)的細(xì)菌殺菌活性。VflT6SS2的三個(gè)Hcp效應(yīng)子的殺菌實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,TssD2_a和TssD2_b的缺失對(duì)細(xì)菌殺菌能力的影響很有限,但它們的雙缺失株卻極大地降低了細(xì)菌的殺菌能力,這表明TssD2a和TssD2b在功能上冗余的,但對(duì)于VflT6SS2介導(dǎo)的抗菌活性是必須的。TssD2c的缺失對(duì)于細(xì)菌殺菌的影響很有限,這也提示TssD2c可能對(duì)于VflT6SS2介導(dǎo)的殺菌活性是非必需的。85003中另一個(gè)T6SS基因簇VflT6SSl,在常規(guī)培養(yǎng)條件下,基因的mRNA表達(dá)水平很低,說明VflT6SS1在常規(guī)培養(yǎng)條件下未對(duì)細(xì)菌殺傷能力有貢獻(xiàn)�？傊�,我們的研究提示了 VflT6SS2能夠給予河弧菌在海洋環(huán)境中獲得競爭優(yōu)勢(shì),它的活性能夠被如溫度和鹽濃度等環(huán)境信號(hào)所調(diào)控。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R378

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本文編號(hào)：2342440