【摘要】：中心體是動物細(xì)胞和低等植物細(xì)胞內(nèi)的一種重要的無膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器。在細(xì)胞分裂過程中負(fù)責(zé)兩極的建立,確保細(xì)胞分裂過程的對稱性,保證了細(xì)胞分裂進(jìn)程中遺傳物質(zhì)的平均分配。在電鏡下,中心體由一對互相垂直排列的中心粒及致密度很高的中心粒周圍物質(zhì)所組成。其功能的發(fā)揮主要依靠中心粒周圍物質(zhì)內(nèi)的蛋白。目前,中心體蛋白在有絲分裂中的定位和功能研究已經(jīng)取得了很多成果。按照這些蛋白在有絲分裂中發(fā)揮功能的階段,大致可以分為四類:第一類參與了間期細(xì)胞的中心粒復(fù)制,中心粒復(fù)制始于G1晚期或S早期,完成于S期;第二類參與了細(xì)胞周期G2/M的轉(zhuǎn)換,通過與Cdk1的相互作用啟動有絲分裂;第三類在前期直接參與了紡錘體微管的組裝,第四類則參與了有絲分裂末期胞質(zhì)的分裂。但是在沒有中心體形成的減數(shù)分裂進(jìn)程中,中心體蛋白能否發(fā)揮功能,其功能與有絲分裂中的功能有何異同,仍然是沒有涉及的領(lǐng)域。本課題針對以上相關(guān)問題,利用小鼠的未成熟卵母細(xì)胞,參照NCBI的數(shù)據(jù),從以上四類中心體蛋白中,各選取一種在卵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量較高的蛋白,研究其在卵母細(xì)胞體外成熟不同階段中的表達(dá)和定位,采用基因敲減和或過表達(dá)技術(shù),阻遏或增強(qiáng)他們的表達(dá),從而探索其在卵母細(xì)胞體外成熟中的功能。本研究分為三個部分,分別研究了這幾種蛋白的定位及功能。其中Cep70因基因敲減后對卵母細(xì)胞的GVBD率和PB1排出率沒有影響,放棄對其進(jìn)行定位和功能的研究。第一部分Cep蛋白在卵母細(xì)胞體外成熟進(jìn)程中的表達(dá)及定位目的:確定中心體蛋白Cep55在卵母細(xì)胞體外成熟不同階段的表達(dá)及亞細(xì)胞定位,了解其對卵母細(xì)胞體外成熟進(jìn)程的影響。方法:1.用Western blotting方法檢測四類蛋白在卵母細(xì)胞體外成熟四個重要階段中的表達(dá)情況;2.用熒光染色和活細(xì)胞顯像的方法,確定四類蛋白在卵母細(xì)胞體外成熟幾個重要階段中的亞細(xì)胞定位;結(jié)果:1.表達(dá)量:在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂四個重要階段(間期,第一次減數(shù)分裂前期,第一次減數(shù)分裂中期,第二次減數(shù)分裂中期),這四種蛋白的表達(dá)量都是恒定不變的。2.亞細(xì)胞定位:在間期,這三種蛋白均定位于卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi),接近中心的位置,但是Cep55在星體上也有定位;在減數(shù)分裂開始后,這三種蛋白都開始散布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi),在第一次和第二次減數(shù)分裂中期,這三種蛋白在紡錘體兩極都有定位,且與γ-tubulin有部分重疊;但Cep63主要定位于兩極,Cep120在紡錘體上有少量定位,Cep55則分布在整個紡錘體,且在胞質(zhì)分裂階段定位于中體。結(jié)論:Cep蛋白家族成員在有絲分裂與減數(shù)分裂中的表達(dá)模式和定位具有相同和不同之處。第二部分四種Cep蛋白的敲減/過表達(dá)對卵母細(xì)胞GVBD和PB1排出的影響目的:確定四類中心體蛋白是否影響卵母細(xì)胞的GVBD和PB1排出方法:1.用特異性Si RNA/Morpholino注射的方法進(jìn)行基因敲減,檢測基因敲減后這四類蛋白的表達(dá)水平;2.用特異性Si RNA/Morpholino注射的方法進(jìn)行基因敲減,,體式鏡下觀察這四類蛋白對卵母細(xì)胞GVBD率及第一極體排出率的影響。結(jié)果:1.四種中心體蛋白基因敲減效果良好;2.四種中心體蛋白的敲減均未引起卵母細(xì)胞GVBD率的變化;除Cep70的敲減未引起改變外,其他三種蛋白的敲減均引起卵母細(xì)胞PB1排出率的降低。結(jié)論:Cep蛋白家族的某些成員在減數(shù)分裂過程中起到重要作用。第三部分Cep蛋白敲減/過表達(dá)對卵母細(xì)胞第一次減數(shù)分裂中期紡錘體組裝及中后期轉(zhuǎn)換的影響目的:確定三種中心體蛋白對卵母細(xì)胞體外成熟進(jìn)程重要進(jìn)程的影響方法:1.用熒光染色的方法,確定Cep蛋白的敲減/過表達(dá)是否影響卵母細(xì)胞MI紡錘體的形態(tài)和染色體排列,初步探討其引起紡錘體形態(tài)改變的機(jī)制。2.用Western blotting確定Cep蛋白的敲減對中后期轉(zhuǎn)換時cyclin B1表達(dá)水平和同源染色體分離的影響,初步探討其影響極體排放的原因。3.利用染色體鋪片的方法,確定Cep蛋白敲減后引起PB1排出率降低的機(jī)制。結(jié)果:1.三種蛋白的敲減都引起卵母細(xì)胞MI紡錘體的形態(tài)異常,但在Cep55和Cep120敲減引起的異常中以紡錘體極性損害為主,Cep63敲減引起的異常更加明顯,不僅引起極性的損害,還引起紡錘體形態(tài)更多的異常及染色體排列的異常。Cep55的過表達(dá)未引起紡錘體形態(tài)的變化,Cep120的過表達(dá)則引起多極紡錘體的產(chǎn)生。2.三種蛋白的敲減均引起紡錘體極性的損害——γ-tubulin的解聚3.三種蛋白的敲減均引起中后期轉(zhuǎn)換的障礙:cyclin B1不降解,同源染色體不分離。4.三種蛋白敲減后均引起紡錘體檢驗點的激活,結(jié)論:三種蛋白進(jìn)行基因敲減后紡錘體檢驗點的激活阻遏中后期轉(zhuǎn)換,從而引起PB1排出率降低。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R321

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本文編號：2342214