【摘要】：田鼠巴貝蟲(Babesia microti)是一種寄生在紅細(xì)胞內(nèi)人獸共患的血液原蟲,傳播媒介是蜱,主要通過蜱蟲叮咬和血液傳播。該蟲屬于頂復(fù)門(Phylum Apicomplexa)、孢子蟲綱(Class Sporozose)、梨形蟲亞綱(Subclass Prioplasmasina)、梨形蟲目(Order Prioplasmasina)、巴貝蟲科(Family Babesidae)。它與其它頂復(fù)門原蟲具有相似的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)并能分泌與入侵相關(guān)的保守蛋白,尤其是在入侵宿主細(xì)胞階段分泌的棒狀體相關(guān)蛋白(rhoptry-associated protein,RAP)被認(rèn)為是抵抗寄生蟲入侵和繁殖的關(guān)鍵分子,該蛋白在蟲體入侵的納蟲空泡形成過程中發(fā)揮了重要作用。同時以往研究指出其他巴貝蟲棒狀體相關(guān)蛋白是該病的候選診斷抗原和疫苗,但是關(guān)于田鼠巴貝蟲棒狀體相關(guān)蛋白的研究較少,因此本研究致力于棒狀體相關(guān)蛋白的制備及免疫性能分析,旨在為后續(xù)相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。目的本研究旨在通過篩選不同數(shù)據(jù)庫獲得田鼠巴貝蟲棒狀體相關(guān)蛋白(Babesia microti rhoptry-associated protein,BmRAP)的基因序列和氨基酸序列;經(jīng)過生物信息學(xué)分析確定截短表達(dá)蛋白序列,重組表達(dá)得到純化的C-BmRAP和N-BmRAP;免疫BALB/c鼠,驗(yàn)證該蛋白的抗感染免疫效應(yīng),為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。方法通過篩選 NCBI、Uniprot、EMBL-EBI、GeneDB 以及 PiroplasmaDB 專業(yè)網(wǎng)站,搜索BmRAP目的基因;經(jīng)過生物信息學(xué)分析,了解蛋白基本理化性質(zhì)、信號肽、跨膜區(qū)和抗原表位等性質(zhì),確定截短表達(dá)的C-BmRAP和N-BmRAP基因序列,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,分析其親緣關(guān)系及基因保守性;利用原核表達(dá)系統(tǒng),設(shè)計引物,構(gòu)建重組載體,體外克隆表達(dá)C-BmRAP和N-BmRAP重組蛋白并進(jìn)行純化;用純化后重組蛋白免疫BALB/c鼠,三次免疫后感染田鼠巴貝蟲,薄血片記錄小鼠感染巴貝蟲密度,測量小鼠體重及其脾臟重量,血液血常規(guī)分析及細(xì)胞因子檢測評價重組蛋白C-BmRAP和N-BmRAP抗感染免疫效果。結(jié)果1)在EMBL-EBI和PiroplasmaDB中各篩選出1條田鼠巴貝蟲棒狀體相關(guān)蛋白基因,登錄號分別為XP_012649548和BBM_Ⅲ04695。通過軟件APE進(jìn)行序列比對,兩個基因序列完全一致,證明為同一條基因序列。該基因共含有4 443 bp,可編碼1 480個氨基酸。編碼蛋白分子量為165.31KDa,為分泌蛋白,含 1 個信號肽,4 個跨膜區(qū)(7-29aa/1 256-1 278aa/1 377-1399aa 和 1 414-1433aa),并含有較多抗原表位,且系統(tǒng)進(jìn)化分析揭示其與頂復(fù)門其他蟲種RAP具有親緣關(guān)系,同源性分析結(jié)果BmRAP與BbRAP和BdRAP的同源性分別為68%和67%。2)通過生物信息學(xué)蛋白結(jié)構(gòu)及抗原表位分析,最終確定了 C-端截短和N-端截短的田鼠巴貝蟲棒狀體相關(guān)蛋白(即C-BmRAP和N-BmRAP)基因序列,并成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體,蛋白誘導(dǎo)表達(dá)經(jīng)純化后獲得較高純度的重組C-BmRAP和N-BmRAP蛋白。3)動物三次免疫,田鼠巴貝蟲入侵感染后,重組C-BmRAP和N-BmRAP蛋白免疫組和正常對照組的全血涂片計數(shù)結(jié)果在感染第7d,N-BmRAP、C-BmRAP免疫組和對照組紅細(xì)胞感染率分別為30%、28%和50%,蛋白免疫組感染率低于對照組;血常規(guī)檢測結(jié)果中,白細(xì)胞(White Blood Cell,WBC)在各組間無明顯差異(F= 1.842,P0.05);在感染第7天,紅細(xì)胞(Red Blood Cell,RBC)數(shù)量降到最低(N-BmRAP和C-BmRAP蛋白免疫組和正常對照組RBC分別為(5.70±3.46)×1012/L、(4.72±1.36)×1012/L、(3.42±1.09)×1012/L),RBC的檢測結(jié)果在各組間有明顯差異(F=8.096,P0.05)。4)從脾臟形態(tài)上看,重組蛋白免疫以后小鼠脾臟腫大,感染B.m后小鼠脾臟更大,對照組在感染14d脾臟長度最大,C-BmRAP和N-BmRAP蛋白免疫組小鼠脾臟變化無對照組明顯;在感染B.m后第7d,TNF、IFN-γ和IL-10比處理前含量增加,IL-2、IL-4、IL-6和IL-10無明顯增加;在感染后第21d,只有TNF無明顯高峰,其余指標(biāo)居于高峰狀態(tài)。結(jié)論1)采用生物信息學(xué)方法預(yù)測田鼠巴貝蟲棒狀體相關(guān)蛋白含有較多的抗原表位,該蛋白可作為疫苗的候選分子。2)克隆表達(dá)了 C-端截短和N-端截短的田鼠巴貝蟲棒狀體相關(guān)蛋白,經(jīng)純化后獲得較高純度的重組蛋白,為進(jìn)一步研究該蛋白的結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)。3)C-BmRAP和N-BmRAP蛋白免疫組和正常感染組的血液涂片及血液學(xué)指標(biāo)結(jié)果顯示N-BmRAP有較好的近期免疫保護(hù)作用,C-BmRAP免疫保護(hù)能力相對較弱,N-BmRAP可用于進(jìn)一步的疫苗研究。4)細(xì)胞因子檢測結(jié)果顯示C-BmRAP和N-BmRAP可刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng),該蛋白具有一定的免疫保護(hù)力,可以作為田鼠巴貝蟲疫苗的候選靶標(biāo)。
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【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R382

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本文編號：2339273