【摘要】：田鼠巴貝蟲(Babesia microti)是一種寄生在紅細胞內人獸共患的血液原蟲,傳播媒介是蜱,主要通過蜱蟲叮咬和血液傳播。該蟲屬于頂復門(Phylum Apicomplexa)、孢子蟲綱(Class Sporozose)、梨形蟲亞綱(Subclass Prioplasmasina)、梨形蟲目(Order Prioplasmasina)、巴貝蟲科(Family Babesidae)。它與其它頂復門原蟲具有相似的亞細胞結構并能分泌與入侵相關的保守蛋白,尤其是在入侵宿主細胞階段分泌的棒狀體相關蛋白(rhoptry-associated protein,RAP)被認為是抵抗寄生蟲入侵和繁殖的關鍵分子,該蛋白在蟲體入侵的納蟲空泡形成過程中發(fā)揮了重要作用。同時以往研究指出其他巴貝蟲棒狀體相關蛋白是該病的候選診斷抗原和疫苗,但是關于田鼠巴貝蟲棒狀體相關蛋白的研究較少,因此本研究致力于棒狀體相關蛋白的制備及免疫性能分析,旨在為后續(xù)相關研究奠定基礎。目的本研究旨在通過篩選不同數據庫獲得田鼠巴貝蟲棒狀體相關蛋白(Babesia microti rhoptry-associated protein,BmRAP)的基因序列和氨基酸序列;經過生物信息學分析確定截短表達蛋白序列,重組表達得到純化的C-BmRAP和N-BmRAP;免疫BALB/c鼠,驗證該蛋白的抗感染免疫效應,為后續(xù)研究奠定基礎。方法通過篩選 NCBI、Uniprot、EMBL-EBI、GeneDB 以及 PiroplasmaDB 專業(yè)網站,搜索BmRAP目的基因;經過生物信息學分析,了解蛋白基本理化性質、信號肽、跨膜區(qū)和抗原表位等性質,確定截短表達的C-BmRAP和N-BmRAP基因序列,構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹,分析其親緣關系及基因保守性;利用原核表達系統(tǒng),設計引物,構建重組載體,體外克隆表達C-BmRAP和N-BmRAP重組蛋白并進行純化;用純化后重組蛋白免疫BALB/c鼠,三次免疫后感染田鼠巴貝蟲,薄血片記錄小鼠感染巴貝蟲密度,測量小鼠體重及其脾臟重量,血液血常規(guī)分析及細胞因子檢測評價重組蛋白C-BmRAP和N-BmRAP抗感染免疫效果。結果1)在EMBL-EBI和PiroplasmaDB中各篩選出1條田鼠巴貝蟲棒狀體相關蛋白基因,登錄號分別為XP_012649548和BBM_Ⅲ04695。通過軟件APE進行序列比對,兩個基因序列完全一致,證明為同一條基因序列。該基因共含有4 443 bp,可編碼1 480個氨基酸。編碼蛋白分子量為165.31KDa,為分泌蛋白,含 1 個信號肽,4 個跨膜區(qū)(7-29aa/1 256-1 278aa/1 377-1399aa 和 1 414-1433aa),并含有較多抗原表位,且系統(tǒng)進化分析揭示其與頂復門其他蟲種RAP具有親緣關系,同源性分析結果BmRAP與BbRAP和BdRAP的同源性分別為68%和67%。2)通過生物信息學蛋白結構及抗原表位分析,最終確定了 C-端截短和N-端截短的田鼠巴貝蟲棒狀體相關蛋白(即C-BmRAP和N-BmRAP)基因序列,并成功構建了原核表達載體,蛋白誘導表達經純化后獲得較高純度的重組C-BmRAP和N-BmRAP蛋白。3)動物三次免疫,田鼠巴貝蟲入侵感染后,重組C-BmRAP和N-BmRAP蛋白免疫組和正常對照組的全血涂片計數結果在感染第7d,N-BmRAP、C-BmRAP免疫組和對照組紅細胞感染率分別為30%、28%和50%,蛋白免疫組感染率低于對照組;血常規(guī)檢測結果中,白細胞(White Blood Cell,WBC)在各組間無明顯差異(F= 1.842,P0.05);在感染第7天,紅細胞(Red Blood Cell,RBC)數量降到最低(N-BmRAP和C-BmRAP蛋白免疫組和正常對照組RBC分別為(5.70±3.46)×1012/L、(4.72±1.36)×1012/L、(3.42±1.09)×1012/L),RBC的檢測結果在各組間有明顯差異(F=8.096,P0.05)。4)從脾臟形態(tài)上看,重組蛋白免疫以后小鼠脾臟腫大,感染B.m后小鼠脾臟更大,對照組在感染14d脾臟長度最大,C-BmRAP和N-BmRAP蛋白免疫組小鼠脾臟變化無對照組明顯;在感染B.m后第7d,TNF、IFN-γ和IL-10比處理前含量增加,IL-2、IL-4、IL-6和IL-10無明顯增加;在感染后第21d,只有TNF無明顯高峰,其余指標居于高峰狀態(tài)。結論1)采用生物信息學方法預測田鼠巴貝蟲棒狀體相關蛋白含有較多的抗原表位,該蛋白可作為疫苗的候選分子。2)克隆表達了 C-端截短和N-端截短的田鼠巴貝蟲棒狀體相關蛋白,經純化后獲得較高純度的重組蛋白,為進一步研究該蛋白的結構和功能奠定了基礎。3)C-BmRAP和N-BmRAP蛋白免疫組和正常感染組的血液涂片及血液學指標結果顯示N-BmRAP有較好的近期免疫保護作用,C-BmRAP免疫保護能力相對較弱,N-BmRAP可用于進一步的疫苗研究。4)細胞因子檢測結果顯示C-BmRAP和N-BmRAP可刺激機體產生免疫反應,該蛋白具有一定的免疫保護力,可以作為田鼠巴貝蟲疫苗的候選靶標。
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【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R382

【參考文獻】

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本文編號：2339273