【摘要】：隨著中國人口老齡化趨于嚴(yán)峻,截至目前全國超過60歲以上的人口已超過2億。伴隨著人口老齡化隨之而來的各種衰老產(chǎn)生的疾病,心血管疾病、惡性腫瘤、神經(jīng)退行性疾病(阿爾茲海默、帕金森等)、腦血管病(中風(fēng)等)、糖尿病等多種衰老相關(guān)疾病嚴(yán)重影響著老年人的生活,同時(shí)也給家庭和社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)和精神上的負(fù)擔(dān),嚴(yán)重阻礙國家經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和社會(huì)的和諧穩(wěn)定。因此,研究衰老相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制,治療衰老相關(guān)疾病,甚至延緩衰老預(yù)防疾病的發(fā)生是當(dāng)今我國醫(yī)學(xué)科學(xué)研究需要解決的重大課題。人的衰老受多重因素影響,由于成年后人體器官趨于穩(wěn)定,只有少數(shù)器官具有部分再生功能,受到環(huán)境和自身遺傳因素的共同作用,機(jī)體器官產(chǎn)生越來越多的炎癥、基因突變,最終導(dǎo)致細(xì)胞代謝異常乃至器官衰老功能失常。與衰老相關(guān)的基因有很多,其中SIRT1扮演著重要的角色,研究顯示SIRT1在酵母中可以延長酵母的壽命[1],在動(dòng)物體內(nèi)也有延緩衰老延長壽命的作用[2]。進(jìn)一步的研究顯示,SIRT1參與細(xì)胞生命活動(dòng)的多種過程,作為基因沉默調(diào)節(jié)子調(diào)節(jié)基因的表達(dá),通過Foxo家族參與細(xì)胞氧化應(yīng)激及自噬[3,4],去乙�；痯53抑制其促細(xì)胞凋亡作用[5],作為腫瘤抑制因子逆向調(diào)節(jié)c-myc和mTOR通路[6],作用于下丘腦影響生物節(jié)律和攝食行為[7-10]�？傊甋IRT1對(duì)細(xì)胞有多種的生物調(diào)節(jié)功能,為了對(duì)SIRT1有更多的了解,因此需要尋找SIRT1更多的相互作用蛋白。我們首先采用篩選互作蛋白的經(jīng)典方法——酵母雙雜交,根據(jù)需求構(gòu)建了酵母雙雜交系統(tǒng)的誘餌融合蛋白BD-SIRT1,并檢測其對(duì)酵母菌株Y2HGOLD無毒性、無自激活現(xiàn)象后,與人源的腦組織cDNA文庫進(jìn)行雜交,我們最后篩選得到了 27個(gè)可能與SIRT1存在相互作用的蛋白。由于人力有限我們需要從這27個(gè)蛋白中挑選若干個(gè)蛋白進(jìn)行驗(yàn)證并最終選擇一個(gè)蛋白進(jìn)行生物學(xué)功能研究。這27個(gè)蛋白中有轉(zhuǎn)錄因子、線粒體相關(guān)蛋白、溶酶體相關(guān)蛋白、囊泡相關(guān)蛋白和翻譯相關(guān)蛋白等。由于線粒體作為細(xì)胞的能量工廠,在細(xì)胞衰老病變過程中往往伴隨著線粒體功能的異常,其中神經(jīng)退行性疾病如阿爾茲海默、帕金森都伴隨著線粒體功能的破壞,在腦缺血再灌注過程中同樣伴隨著線粒體的鈣超載所產(chǎn)生的過量超氧化物引起的細(xì)胞死亡,因此研究SIRT1與線粒體的關(guān)系成為我們關(guān)注的重點(diǎn)。我們得到5個(gè)與線粒體相關(guān)的候選蛋白:DCTN6、ATP5F1、MICU1、SLC25A5、MFF。經(jīng)過現(xiàn)有的研究報(bào)道,我們重點(diǎn)關(guān)注MICU1。MICU1(mitochondrial calcium uptake])全名為線粒體鈣攝取蛋白1,主要功能是調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)膜的鈣通道MCU,使細(xì)胞在正常的情況下建立適當(dāng)?shù)拟}攝取水平,維持細(xì)胞線粒體代謝的穩(wěn)定性,防止細(xì)胞由于鈣超載而產(chǎn)生過量的活性氧自由基,破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。研究顯示在MICU1穩(wěn)定敲除的細(xì)胞中,細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生較高水平基礎(chǔ)鈣,使細(xì)胞處于高氧化應(yīng)激狀態(tài)。我們知道激活SIRT1大部分時(shí)候是對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用,抑制SIRT1則會(huì)使細(xì)胞更易發(fā)生凋亡壞死,而且我們的實(shí)驗(yàn)顯示SIRT1在線粒體內(nèi)有表達(dá),這與文獻(xiàn)的報(bào)導(dǎo)一致。那么激活SIRT1所產(chǎn)生的對(duì)細(xì)胞的種種保護(hù)作用是否也通過MICU1來維持線粒體的鈣穩(wěn)定,這是我們接下來要研究的內(nèi)容。為了驗(yàn)證SIRT1和MICU1相互作用的可靠性,我們先進(jìn)行體外的結(jié)合實(shí)驗(yàn):首先我們?cè)贖ela細(xì)胞中表達(dá)質(zhì)粒MICU1-HA,然后用含蛋白酶抑制劑的PBS制取細(xì)胞裂解液備用,同時(shí)構(gòu)建質(zhì)粒并在細(xì)菌中表達(dá)純化融合蛋白GST(對(duì)照組)和GST-SIRT1做pull-down實(shí)驗(yàn),免疫印跡實(shí)驗(yàn)顯示SIRT1和MICU1在體外是存在相互作用的。細(xì)胞內(nèi)結(jié)合實(shí)驗(yàn):我們分別在Hela細(xì)胞中表達(dá)SIRTl-flag、MICU1-HA、SIRT1-flag+MICU1-HA、SIRT1-flag+MICU1-HA 四組質(zhì)粒,然后以IgG或flag抗體做免疫沉淀,我們得到的結(jié)果顯示SIRT1和MICU1在Hela細(xì)胞中存在相互作用。在Hela細(xì)胞內(nèi)表達(dá)質(zhì)粒MICU1-HA,通過細(xì)胞免疫熒光共標(biāo)實(shí)驗(yàn),我們?cè)诠簿劢癸@微鏡下可以觀察到外源性的MICU1-HA和內(nèi)源性的SIRT1存在共定位。在正常的細(xì)胞中SIRT1和MICU1是否也存在結(jié)合作用,為了回答這個(gè)問題,我們培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元提取蛋白,使用SIRT1抗體做免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示SIRT1和MICU1在神經(jīng)元內(nèi)存在相互作用,在神經(jīng)元內(nèi)表達(dá)MICU1-HA質(zhì)粒并以HA和SIRT1抗體做免疫熒光共標(biāo)實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示SIRT1和MICU1存在共定位。綜和以上的結(jié)果,我們認(rèn)為SIRT1和MICU1在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外存在相互作用。那么SIRT1和MICU1的結(jié)合作用具有什么樣的生物學(xué)功能呢?我們知道MICU1主要的功能是調(diào)節(jié)線粒體的鈣攝取,那么SIRT1是否通過MICU1調(diào)節(jié)線粒體的鈣攝取?首先我們需要確定SIRT1對(duì)線粒體鈣是否存在影響。通過抑制或激活SIRT1的活性觀察其對(duì)線粒體鈣攝取的影響,使用DMSO做對(duì)照,10μ 白藜蘆醇(resveratrol)作為 SIRT1 的激動(dòng)劑,10mmM 煙酰胺(NAM)和 10μM EX527作為SIRT1的抑制劑,分別提前1h處理細(xì)胞,然后孵浴線粒體鈣染料/AM半小時(shí)后洗去染料并于共聚焦顯微鏡下觀察Rhod-2熒光強(qiáng)度(代表線粒體基質(zhì)內(nèi)的鈣濃度),記錄1分鐘基礎(chǔ)值后使用100μ 組胺(histamine)誘導(dǎo)線粒體鈣內(nèi)流,觀察的結(jié)果顯示:在未誘導(dǎo)鈣內(nèi)流的情況下各組熒光強(qiáng)度DMSO組為33.647±10.93%,NAM 組為 39.553± 16.89%,EX527 組為 46.077± 19.73%,Resveratrol組為32.73±11.37%,各組間無顯著性差異,這說明在無外界刺激的情況卜下抑制或激活SIRT1的活性對(duì)線粒體的基礎(chǔ)鈣攝取無影響,但是在組胺誘導(dǎo)鈣內(nèi)流的情況下,各組的鈣信號(hào)水平DMSO組為107.78±9.36%,NAM組為173.27±7.31%,EX 527 組為 185.92士 17.44%,Resveratrol 組為 122.29± 17.58,NAM、EX527和Resvertarol組分別與DMSO對(duì)照組進(jìn)行比較,使用SIRT1抑制劑的兩組NAM(p0.05)和EX527(p0.05)顯著增加鈣內(nèi)流的幅度,這說明抑制SIRT1活性使得鈣大量內(nèi)流時(shí)線粒體對(duì)鈣的攝取失去了正常的控制能力,線粒體鈣離子通道開放量增加。同樣我們使用shRNA干擾SIRT1的表達(dá),無刺激的情況下線粒體鈣濃度:對(duì)照組shNC(68.541±5.34%)和SIRT1干擾組(61.648±5.59%)無顯著性差異;在histamine誘導(dǎo)鈣內(nèi)流的情況下對(duì)照組shNC(90.295±2.83%)和SIRT1干擾組(121.835±2.83%)(p0.05)對(duì)比具有顯著性差異。因此我們得出結(jié)論,SIRT1是可以影響線粒體對(duì)鈣的攝取的,至少在外界因素刺激下引起的鈣過載,抑制SIRT]會(huì)增強(qiáng)這個(gè)過程,這可能使線粒體因過量的鈣導(dǎo)致線粒體鈣超載,引起線粒體的溶解破裂,誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡壞死,這與目前的研究結(jié)論相吻合,即多數(shù)情況下抑制SIRT1的活性不利于細(xì)胞在外界刺激環(huán)境下存活。那么SIRT1對(duì)線粒體的這種作用是不是通過MICU1起作用的?為了驗(yàn)證這個(gè)問題,我么首先在Hela細(xì)胞內(nèi)表達(dá)MICU1-HA、,24小時(shí)后兩組細(xì)胞都提前1小時(shí)處理的EX527抑制SIRT1的活性,然后在共聚焦顯微鏡下檢測線粒體內(nèi)鈣濃度,結(jié)果顯示過表達(dá)MICU1-HA組和PCMV-HA(對(duì)照組)的Hela細(xì)胞中,線粒體鈣水平在使用組胺誘導(dǎo)鈣內(nèi)流前無顯著差異,這說明過表達(dá)M1CU1在正常情況下對(duì)線粒體的鈣攝取水平無影響,與文獻(xiàn)的報(bào)導(dǎo)一致,同時(shí)在誘導(dǎo)鈣超載的過程中過表達(dá)MICU1組所產(chǎn)生的最大鈣濃度(90.665±4.78%)顯著低于對(duì)照組(157.819±3.87%)(p0.05),這說明了抑制SIRT1所產(chǎn)生的鈣超載增強(qiáng)現(xiàn)象部分是通過MICU1介導(dǎo)的。我們知道SIRT1作為NAD依賴的去乙�；讣易宓某蓡T,其主要發(fā)揮生物學(xué)功能的方式是通過對(duì)底物的去乙�；瘉碚{(diào)節(jié)底物的活性實(shí)現(xiàn)的,那么MICU1是否作為SIRT1的去乙�；孜锬�?我們?cè)贖ela細(xì)胞中表達(dá)MICU1-HA,24小時(shí)后分別處理DMSO(對(duì)照)和10 μ M EX527,再使用HA抗體將MICU1-HA純化出來,western檢測兩組樣品中MICU1的乙酰化程度,發(fā)現(xiàn)沒有明顯的變化,因此我們推斷MICU1不是SIRT1的去乙�；孜�。綜上所述,在Hela細(xì)胞和神經(jīng)元內(nèi)SIRT1可以直接和MICU1相互作用,同時(shí)抑制SIRT1的活性可通過MICU1增強(qiáng)線粒體在組胺誘導(dǎo)鈣超載下的鈣內(nèi)流強(qiáng)度,使細(xì)胞更易于鈣超載,但是SIRT1并不是通過對(duì)MICU1的去乙酰化來調(diào)節(jié)它的活性。我們的發(fā)現(xiàn)揭示了 SIRT1調(diào)節(jié)生物過程的新機(jī)制,為尋找新的藥物靶點(diǎn)提供的新的方向。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R3416

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本文編號(hào)：2336368