發(fā)布時(shí)間：2018-11-16 18:49

【摘要】：【目的】構(gòu)建人源特異性抗3型、7型腺病毒Fab噬菌體抗體庫(kù),篩選人源抗3型、7型腺病毒中和活性抗體�！痉椒ā繌暮锌�3型和7型腺病毒高中和效價(jià)(㧐1:1000)抗體的志愿者全血中分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),提取總RNA后經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)制備c DNA,然后以cDNA為模板分別擴(kuò)增抗體輕鏈、重鏈可變區(qū)序列,再以pComb3噬菌體質(zhì)粒為模板分別擴(kuò)增輕鏈恒定區(qū)(Cκ/λ)和重鏈恒定區(qū)(CH1),將輕鏈可變區(qū)和輕鏈恒定區(qū)進(jìn)行重疊延伸PCR(SOE-PCR),重鏈可變區(qū)和重鏈恒定區(qū)進(jìn)行SOE-PCR,分別形成κ/λ輕鏈和Fd重鏈,再以κ/λ輕鏈和Fd重鏈為模板進(jìn)行SOE-PCR,最終形成完整的Fab基因,Fab基因連接至p Comb3噬菌體質(zhì)粒中,電轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue,以輔助噬菌體M13KO7進(jìn)行超感染,構(gòu)建人源特異性抗3型、7型腺病毒Fab噬菌體抗體庫(kù)。以純化的3型、7型腺病毒完整病毒顆粒作為抗原進(jìn)行親和篩選,經(jīng)過(guò)4輪篩選,富集特異性結(jié)合抗3型、7型腺病毒噬菌體抗體�；瘜W(xué)發(fā)光酶免分析法(CLEIA)鑒定每一輪篩選后的總噬菌體以及第四輪篩選后的噬菌體單克隆,同時(shí)對(duì)獲得的陽(yáng)性克隆進(jìn)行型別(Adv14、Adv55)特異性檢測(cè)。獲得的陽(yáng)性單克隆進(jìn)行DNA測(cè)序,然后將抗體序列IMGT/V-QUEST數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行抗體序列分析,確定其CDR區(qū)和重輕鏈型別。從陽(yáng)性克隆中提取質(zhì)粒Pcomb3-Fab作為模板,分別擴(kuò)增特異性輕鏈、重鏈可變區(qū)基因,并利用同源重組方法分別將輕、重鏈可變區(qū)基因克隆至真核表達(dá)載體Igk和IgH。共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá),轉(zhuǎn)染72h后收取細(xì)胞上清先用化學(xué)發(fā)光酶免分析法(CLEIA)、SDS-PAGE鑒定抗體的表達(dá),然后再用CLEIA鑒定與腺病毒的結(jié)合活性�！窘Y(jié)果】由于輕鏈的不同,分別構(gòu)建了容量為3.0×109(輕鏈?zhǔn)铅?和1.8×109(輕鏈?zhǔn)铅?的抗3型、7型腺病毒的Fab噬菌體抗體庫(kù),Fab(Κ)和Fab(λ)基因插入率均接近100%。用純化的3型腺病毒顆粒作為抗原從Fab庫(kù)中篩選抗體,未篩選到與3型腺病毒特異性結(jié)合的陽(yáng)性克隆;用純化的7型腺病毒顆粒作為抗原從Fab庫(kù)中篩選抗體,獲得了4株與7型腺病毒特異性結(jié)合的陽(yáng)性克隆,分別是5C、5D、9F、9H,型別特異性檢測(cè)表明4株陽(yáng)性克隆與3型、14型、55型腺病毒也有結(jié)合活性。陽(yáng)性克隆進(jìn)行DNA測(cè)序后在IMGT/V-QUEST數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行分析比對(duì),結(jié)果顯示4株克隆序列各不相同,其中5C、9H的輕鏈型別是Κ,5D、9F的輕鏈型別是λ。4株陽(yáng)性克隆的重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)分別與人胚系免疫球蛋白基因有高度的同源性。5C、9H的Κ輕鏈可變區(qū)成功克隆入Igκ,5C、9F和9H重鏈可變區(qū)成功克隆入Ig H,2條輕鏈和3條重鏈組合成6個(gè)抗體,并在293T細(xì)胞表達(dá)。表達(dá)的細(xì)胞上清經(jīng)CLEIA鑒定,6個(gè)抗體均得到表達(dá),其中抗體組合2和組合5表達(dá)量相對(duì)較好,CLEIA鑒定結(jié)果顯示與Adv7有結(jié)合活性。表達(dá)量相對(duì)較好的上清經(jīng)SDS-PAGE鑒定,在還原和非還原狀態(tài)下均未見(jiàn)目的條帶,說(shuō)明抗體表達(dá)量較低。全抗體型別特異性檢測(cè)結(jié)果表明,表達(dá)量較好的抗體組合2和組合5與Adv3、Adv14、Adv55也有結(jié)合活性。【結(jié)論】成功構(gòu)建了全人源特異性抗3型、7型腺病毒Fab噬菌體抗體庫(kù),篩選到4株與7型腺病毒特異性結(jié)合的抗體,并且抗體與3型、14型、55型腺病毒有結(jié)合活性�？贵w序列轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行全抗體表達(dá),由于抗體表達(dá)量較低,抗體活性需要進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究對(duì)抗腺病毒噬菌體抗體庫(kù)的建立和篩選進(jìn)行了各方面的探索,為未來(lái)抗3型、7型腺病毒治療性抗體的研發(fā)提供參考和借鑒。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2336337