【摘要】：【目的】構(gòu)建人源特異性抗3型、7型腺病毒Fab噬菌體抗體庫,篩選人源抗3型、7型腺病毒中和活性抗體。【方法】從含有抗3型和7型腺病毒高中和效價(㧐1:1000)抗體的志愿者全血中分離外周血單個核細胞(PBMC),提取總RNA后經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)制備c DNA,然后以cDNA為模板分別擴增抗體輕鏈、重鏈可變區(qū)序列,再以pComb3噬菌體質(zhì)粒為模板分別擴增輕鏈恒定區(qū)(Cκ/λ)和重鏈恒定區(qū)(CH1),將輕鏈可變區(qū)和輕鏈恒定區(qū)進行重疊延伸PCR(SOE-PCR),重鏈可變區(qū)和重鏈恒定區(qū)進行SOE-PCR,分別形成κ/λ輕鏈和Fd重鏈,再以κ/λ輕鏈和Fd重鏈為模板進行SOE-PCR,最終形成完整的Fab基因,Fab基因連接至p Comb3噬菌體質(zhì)粒中,電轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue,以輔助噬菌體M13KO7進行超感染,構(gòu)建人源特異性抗3型、7型腺病毒Fab噬菌體抗體庫。以純化的3型、7型腺病毒完整病毒顆粒作為抗原進行親和篩選,經(jīng)過4輪篩選,富集特異性結(jié)合抗3型、7型腺病毒噬菌體抗體�；瘜W發(fā)光酶免分析法(CLEIA)鑒定每一輪篩選后的總噬菌體以及第四輪篩選后的噬菌體單克隆,同時對獲得的陽性克隆進行型別(Adv14、Adv55)特異性檢測。獲得的陽性單克隆進行DNA測序,然后將抗體序列IMGT/V-QUEST數(shù)據(jù)庫中進行抗體序列分析,確定其CDR區(qū)和重輕鏈型別。從陽性克隆中提取質(zhì)粒Pcomb3-Fab作為模板,分別擴增特異性輕鏈、重鏈可變區(qū)基因,并利用同源重組方法分別將輕、重鏈可變區(qū)基因克隆至真核表達載體Igk和IgH。共轉(zhuǎn)染293T細胞進行瞬時表達,轉(zhuǎn)染72h后收取細胞上清先用化學發(fā)光酶免分析法(CLEIA)、SDS-PAGE鑒定抗體的表達,然后再用CLEIA鑒定與腺病毒的結(jié)合活性�！窘Y(jié)果】由于輕鏈的不同,分別構(gòu)建了容量為3.0×109(輕鏈是κ)和1.8×109(輕鏈是λ)的抗3型、7型腺病毒的Fab噬菌體抗體庫,Fab(Κ)和Fab(λ)基因插入率均接近100%。用純化的3型腺病毒顆粒作為抗原從Fab庫中篩選抗體,未篩選到與3型腺病毒特異性結(jié)合的陽性克隆;用純化的7型腺病毒顆粒作為抗原從Fab庫中篩選抗體,獲得了4株與7型腺病毒特異性結(jié)合的陽性克隆,分別是5C、5D、9F、9H,型別特異性檢測表明4株陽性克隆與3型、14型、55型腺病毒也有結(jié)合活性。陽性克隆進行DNA測序后在IMGT/V-QUEST數(shù)據(jù)庫中進行分析比對,結(jié)果顯示4株克隆序列各不相同,其中5C、9H的輕鏈型別是Κ,5D、9F的輕鏈型別是λ。4株陽性克隆的重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)分別與人胚系免疫球蛋白基因有高度的同源性。5C、9H的Κ輕鏈可變區(qū)成功克隆入Igκ,5C、9F和9H重鏈可變區(qū)成功克隆入Ig H,2條輕鏈和3條重鏈組合成6個抗體,并在293T細胞表達。表達的細胞上清經(jīng)CLEIA鑒定,6個抗體均得到表達,其中抗體組合2和組合5表達量相對較好,CLEIA鑒定結(jié)果顯示與Adv7有結(jié)合活性。表達量相對較好的上清經(jīng)SDS-PAGE鑒定,在還原和非還原狀態(tài)下均未見目的條帶,說明抗體表達量較低。全抗體型別特異性檢測結(jié)果表明,表達量較好的抗體組合2和組合5與Adv3、Adv14、Adv55也有結(jié)合活性�！窘Y(jié)論】成功構(gòu)建了全人源特異性抗3型、7型腺病毒Fab噬菌體抗體庫,篩選到4株與7型腺病毒特異性結(jié)合的抗體,并且抗體與3型、14型、55型腺病毒有結(jié)合活性�？贵w序列轉(zhuǎn)染293T細胞進行全抗體表達,由于抗體表達量較低,抗體活性需要進一步驗證。本研究對抗腺病毒噬菌體抗體庫的建立和篩選進行了各方面的探索,為未來抗3型、7型腺病毒治療性抗體的研發(fā)提供參考和借鑒。
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【學位授予單位】：廣州醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：2336337