【摘要】：目的1)明確高遷移率蛋白族 B1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)對(duì) T淋巴細(xì)胞增殖的影響。2)探究 HMGB1 對(duì) p53(tumorprotein 53,p53)表達(dá)的影響。3)通過干擾p53表達(dá),明確p53在介導(dǎo)HMGB1對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖抑制的作用,并進(jìn)一步探討p53在HMGB1誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞凋亡和功能紊亂中的作用。4)檢測(cè)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPKs)通路活性以探索HMGB1誘導(dǎo)p53表達(dá)的可能機(jī)制。5)利用特異性p38抑制劑,明確p38信號(hào)通路在HMGB1誘導(dǎo)p53活化中的作用。方法1)根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間將Jurkat細(xì)胞分為0(正常組)、12、24、48h培養(yǎng)組,將100ng/mlHMGB1加入培養(yǎng)基后培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間;根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)加入HMGB1濃度將Jurkat細(xì)胞分為0(正常組)、10、100、1 000ng/ml組,加入相應(yīng)濃度HMGB1連續(xù)培養(yǎng)24 h。采用CCK-8法檢測(cè)各組Jurkat細(xì)胞增殖情況,熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)細(xì)胞樣本中p53、p21及泛素蛋白酶小鼠雙微體蛋白(murinedouble minute2,mdm2)mRNA 表達(dá)水平,Western blot 檢測(cè)磷酸化 p53 及 p53、p21、mdm2的蛋白表達(dá)水平。2)將載有p53shRNA表達(dá)質(zhì)粒和空白載體的慢病毒轉(zhuǎn)染入Jurkat細(xì)胞中。加入嘌呤霉素對(duì)細(xì)胞進(jìn)行篩選,建立穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。將以上2種細(xì)胞分別分為對(duì)照組和HMGB1 組,加入 100ng/mlHMGB1 培養(yǎng) 24h。CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖,RT-PCR、Western blot法分別檢測(cè)細(xì)胞樣本中p53 mRNA、磷酸化p53和p53蛋白的表達(dá)水平;提取細(xì)胞核蛋白后檢測(cè)活化T細(xì)胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFAT)活性；留取上清采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IFN-y的水平;將細(xì)胞用Annxin V/7-AAD染色后,利用流式細(xì)胞儀分析凋亡細(xì)胞比率,并檢測(cè)凋亡相關(guān)因子B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-celllymphoma-2,bcl-2)、bax和激活胱天蛋白酶(caspase)-3蛋白的表達(dá)水平3)將培養(yǎng)的Jurkat細(xì)胞分為正常組和HMGB1組,予相應(yīng)處理后,Westernblot法檢測(cè)細(xì)胞中磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)1/2、ERK1/2、磷酸化 p38、p38、磷酸化 c-Jun 氨基末端激酶(c-JunN-terminal kinase,JNK)和JNK蛋白表達(dá)水平。4)將培養(yǎng)的Jurkat細(xì)胞分為正常組、HMGB1組和SB203580+HMGB1組,進(jìn)行相應(yīng)處理后,RT-PCR、Western blot 法檢測(cè)細(xì)胞 p53 mRNA、p21 mRNA、mdm2 mRNA的表達(dá)、磷酸化p53及p53蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果1)HMGB1抑制Jurkat細(xì)胞增殖活性HMGB1(100ng/ml)刺激細(xì)胞24、48h后細(xì)胞增殖率降低(P0.05),刺激12h后變化不大;中高濃度HMGB1(100、1000ng/ml)刺激細(xì)胞24h后,增殖率明顯下降(p0.05),HMGB1(10ng/ml)刺激細(xì)胞后無明顯差異。2)HMGB1誘導(dǎo)p53mRNA和蛋白水平表達(dá)增加低濃度HMGB1(10 ng/ml)刺激細(xì)胞即可使p53 mRNA水平、磷酸化p53和p53蛋白水平表達(dá)增加(p0.05),中濃度HMGB1(100ng/ml)刺激細(xì)胞24、48h后p53 mRNA水平逐漸升高、磷酸化p53及p53蛋白表達(dá)水平也相應(yīng)增加(p0.05),且增高的p53水平具有轉(zhuǎn)錄活性,其下游分子mdm2和p21的mRNA表達(dá)增多(p0.05),但高濃度組(1000 ng/ml)變化趨勢(shì)不明顯。3)p53介導(dǎo)HMGB1對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用利用慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建p53 shRNA表達(dá)的Jurkat細(xì)胞和空白對(duì)照細(xì)胞。給予HMGB1刺激后,對(duì)照組細(xì)胞增殖率明顯降低,而p53shRNA表達(dá)細(xì)胞增殖率下降不明顯(p0.05)。4)p53介導(dǎo)HMGB1誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。HMGB1刺激后,空白對(duì)照組中凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多,與之相較,p53 shRNA表達(dá)細(xì)胞凋亡較少(p0.05)。同時(shí),兩組細(xì)胞表達(dá)凋亡相關(guān)因子bcl-2、bax以及caspase-3的水平存在明顯差異,并且和凋亡趨勢(shì)相同(p0.05)。5)p53介導(dǎo)HMGB1對(duì)T細(xì)胞功能的影響。HMGB1刺激后,空白對(duì)照組細(xì)胞中的NF-AT蛋白活性明顯降低,其產(chǎn)生的IL-2減少,并且存在Th2漂移(IFN-γ/IL-4比值降低)。而p53 shRNA表達(dá)細(xì)胞在HMGB1刺激后,以上變化均不明顯(p0.05)。6)p38參與調(diào)節(jié)HMGB1對(duì)p53的活化作用。HMGB1刺激細(xì)胞后,MAPKs三條通路中只有p38被明顯活化。加用特異性p38抑制劑SB203580后,由HMGB1激活的p53 mRNA表達(dá)以及其磷酸化和總蛋白的增加受到明顯抑制制,相應(yīng)地其下游因子mdm2和p21mRNA的轉(zhuǎn)錄減少(p0.05)。結(jié)論:1)HMGB1具有抑制Jurkat細(xì)胞增殖的作用。2)HMGB1可有效激活p53的表達(dá)和活性。3)p53介導(dǎo)HMGB1引起的T細(xì)胞增殖抑制作用。4)p53還可以介導(dǎo)HMGB1誘導(dǎo)的T細(xì)胞凋亡和功能障礙。5)HMGB1可能通過活化p38通路調(diào)節(jié)p53的表達(dá)及活性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣西師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前8條

1 劉心怡;吳佳捷;;高遷移率族蛋白B1基因沉默抑制子宮內(nèi)膜癌侵襲與轉(zhuǎn)移的機(jī)制[J];中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2016年03期

2 高共鳴;農(nóng)魯明;周棟;黃永靜;趙書杰;徐南偉;;白細(xì)胞介素-6通過p38蛋白調(diào)控髓核細(xì)胞的增殖和遷移[J];中華實(shí)驗(yàn)外科雜志;2015年01期

3 Jing Zhang;Cang Liu;Ruiguang Hou;;Knockdown of HMGB1 improves apoptosis and suppresses proliferation and invasion of glioma cells[J];Chinese Journal of Cancer Research;2014年06期

4 Hui Fu;Qiao-sheng Wang;Qiong Luo;Si Tan;Hua Su;Shi-lin Tang;Zheng-liang Zhao;Li-ping Huang;;Simvastatin inhibits apoptosis of endothelial cells induced by sepsis through upregulating the expression of Bcl-2 and downregulating Bax[J];World Journal of Emergency Medicine;2014年04期

5 王苗;趙一鳴;張綠;湯釗猷;樊嘉;王魯;;AGO1調(diào)節(jié)p53表達(dá)與肝細(xì)胞癌根治性切除患者預(yù)后的相關(guān)性[J];中華實(shí)驗(yàn)外科雜志;2014年10期

6 Subhasree Nag;Jiangjiang Qin;Kalkunte S.Srivenugopal;Minghai Wang;Ruiwen Zhang;;The MDM2-p53 pathway revisited[J];The Journal of Biomedical Research;2013年04期

7 Li-feng Huang;Yong-ming Yao;Zhi-yong Sheng;;Novel insights for high mobility group box 1 proteinmediated cellular immune response in sepsis:A systemic review[J];World Journal of Emergency Medicine;2012年03期

8 姚詠明;多器官功能障礙綜合征發(fā)病機(jī)制研究新進(jìn)展[J];中華急診醫(yī)學(xué)雜志;2001年01期

，

本文編號(hào)：2323253