【摘要】：立氏立克次體(Rickettsia rickettsii)是一種嚴格胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性菌,為落基山斑點熱(Rocky Mountain Spotted Fever,RMSF)的病原體。RMSF在自然界主要通過蜱叮咬而傳播,在人為情況下可以通過氣溶膠傳播。RMSF臨床表現(xiàn)主要是急性發(fā)熱、頭疼、肌肉酸痛和皮疹,如果治療不及時出現(xiàn)急性肺水腫、腎衰竭、腦炎等嚴重癥狀而死亡。疫苗的免疫接種是預(yù)防人立氏立克次體自然感染和人為感染的最有效手段。目前,滅活立氏立克次體疫苗的免疫保護效果不理想。立氏立克次體作為一種專性胞內(nèi)寄生菌,其表面蛋白能夠介導(dǎo)立克次體入侵血管內(nèi)皮細胞(宿主細胞)、宿主細胞間遷移、宿主免疫系統(tǒng)激活等,在立克次體感染的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要的角色。因此,鑒定立氏立克次體保護性表面蛋白抗原并用其構(gòu)建亞單位疫苗是近幾十年來RMSF疫苗的主要發(fā)展方向。本研究通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法分離鑒定立氏立克次體主要的細胞表面蛋白,通過動物免疫保護實驗篩選保護性表面蛋白抗原,通過體液免疫和細胞免疫分析探討保護性抗原的免疫保護機制。首先,采用生物素標記立氏立克次體表面蛋白,通過鏈親和素親和層析和雙向電泳分離出已標記的細胞表面蛋白,隨后用電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜對這些表面蛋白進行鑒定。結(jié)果共鑒定出10個主要表面蛋白,其中5個蛋白(Omp A、Omp B、Gro EL、Gro ES、DNA-bing protein)已有報道,另外5個蛋白(Adr1、Adr2、Omp W、Porin_4、Tol C)為新鑒定的立氏立克次體細胞表面蛋白。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),5個新表面蛋白均含有β折疊和信號肽,為多次跨膜蛋白;間接免疫熒光和透射免疫電鏡進一步證實5種新表面蛋白可存在于細胞內(nèi)膜和/或外膜。將5個新表面蛋白基因克隆和原核表達,研制出5個重組蛋白(r Adr1、r Adr2、r Omp W、r Porin-_4、r Tol C)。用這5個重組蛋白分別免疫小鼠制備免疫血清,血清中和實驗揭示r Adr1、r Adr2、r Omp W免疫血清能夠顯著地抑制立克次體入侵宿主細胞,提示這3個蛋白均能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高水平中和抗體。將5個重組蛋白分別免疫小鼠,用立氏立克次體毒株攻擊后顯示r Adr1、r Adr2、r Omp W、r Porin_4等重組蛋白免疫小鼠的肺臟立克次體載量和病理損傷顯著地低于和輕于非免疫小鼠,特別是r Adr2免疫小鼠的肝臟、脾臟和肺臟中立克次體的載量都明顯地低于非免疫小鼠,證明Adr1、Adr2、Omp W和Porin_4是立氏立克次體的保護性抗原,特別是Adr2是一個重要保護性抗原。在前期黑龍江立克次體的研究中發(fā)現(xiàn)重組蛋白r Ybg F具有很好的免疫保護性,蛋白序列比對顯示立氏立克次體和黑龍江立克次體的Ybg F蛋白245個氨基酸序列中僅有6個氨基酸的差異,提示該蛋白為斑點熱群立克次體的保守抗原。透射免疫電鏡觀察確認Ybg F蛋白在立氏立克次體外膜和內(nèi)膜上呈多點分布。血清學(xué)中和試驗證明r Ybg F免疫血清能夠顯著抑制立克次體對血管內(nèi)皮細胞的入侵,提示Ybg F在介導(dǎo)立克次體入侵血管內(nèi)皮細胞過程中起重要作用。此外,小鼠免疫保護實驗發(fā)現(xiàn)r Ybg F免疫組小鼠的肝臟、脾臟和肺臟中立克次體的載量及病理學(xué)損傷程度明顯地低于和輕于非免疫小鼠,證明Ybg F也是立氏立克次體的重要保護性抗原。為了進一步闡明r Adr2和r Ybg F的免疫保護機理,將其分別免疫小鼠,用ELISA檢測首次免疫后第14、28、42、56天血清Ig G、Ig G1和Ig G2a的效價變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高水平特異性Ig G、Ig G1和Ig G2a,特別是Ig G2a與Ig G1的比值隨免疫時相而逐漸上升,說明兩者均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性Ig G2a為主的Th1型體液免疫反應(yīng)。在體外用r Adr2、r Ybg F分別刺激立氏立克次體感染小鼠的CD4+和CD8+T淋巴細胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)r Adr2和r Ybg F均能誘導(dǎo)立克次體抗原致敏的CD4+和CD8+T細胞顯著增殖并分泌高水平的IFN-g和TNF-α,證明r Adr2和r Ybg F均能夠有效誘導(dǎo)Th1型細胞免疫應(yīng)答。許多研究已經(jīng)證明Omp B為立克次體的主要保護性抗原。本研究根據(jù)基因編碼蛋白抗原性和親水性等將立氏立克次體完整的omp B基因(4965bp)分成5個片段并在大腸埃希菌細胞內(nèi)分別表達,制備5個重組蛋白(r Omp B-1~r Omp B-5)。免疫保護實驗顯示這5個重組蛋白均能誘導(dǎo)小鼠對抗立氏立克次體感染,其中r Omp B-4的免疫保護效果最好。將r Omp B-4與r Adr2聯(lián)合免疫小鼠,發(fā)現(xiàn)聯(lián)合免疫小鼠的免疫保護效能顯著好于r Adr2和r Omp B-4的單獨免疫。進一步研究發(fā)現(xiàn)r Omp B-4與r Adr2聯(lián)合疫苗能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生顯著增強的Th1型特異性免疫應(yīng)答,即抗原特異性T細胞產(chǎn)生更高水平IFN-γ和TNF-α及B細胞產(chǎn)生更高水平特異性Ig G2a。貝氏柯克斯體(Coxiella burnetii)是一種隸屬于軍團菌目、類似于立克次體的胞內(nèi)寄生菌,為Q熱的病原體,與立氏立克次體一同被列入生物戰(zhàn)劑。先前的研究表明貝氏柯克斯體氯仿甲醇提取殘留物(chloroform-methanol residue of C.burnetii,CMR-C)是一種潛在的免疫增強劑。本研究將CMR-C與立氏立克次體r Omp B-4混合免疫小鼠,立氏立克次體攻毒結(jié)果顯示混合免疫小鼠臟器中立氏立克次體的載量顯著低于r Omp B-4單獨免疫小鼠,證明CMR-C能夠顯著增強r Omp B-4特異性免疫保護效能。另外,用貝氏柯克斯體攻擊聯(lián)合免疫小鼠,發(fā)現(xiàn)小鼠脾臟柯克斯體載量顯著低于r Omp B-4單獨免疫小鼠,證明該聯(lián)合免疫具有抗立氏立克次體和貝氏柯克斯體的雙重免疫保護效能。進一步研究發(fā)現(xiàn)該聯(lián)合免疫小鼠能夠產(chǎn)生高水平的抗細胞內(nèi)寄生菌關(guān)鍵細胞因子IFN-γ和TNF-α。綜上所述,本研究共發(fā)現(xiàn)了立氏立克次體5個新的細胞表面蛋白(Adr1、Adr2、Omp W、Porin_4、Tol C),其定位于立克次體外膜和/或內(nèi)膜;研究還證明Adr2和Ybg F為立氏立克次體主要保護性抗原,另外證明立氏立克次體外膜蛋白B片段r Omp B-4與r Adr2聯(lián)合免疫的特異性保護效能顯著強于其單獨免疫,以及CMR-C能夠顯著增強r Adr2的特異性免疫保護效能。進一步研究發(fā)現(xiàn)這些有效和增強的特異性免疫保護主要依賴于它們誘導(dǎo)產(chǎn)生的Th1特異性免疫應(yīng)答,包括激活抗原特異性CD4+和CD8+T淋巴細胞產(chǎn)生和分泌高水平IFN-γ和TNF-α,以及激活B淋巴細胞產(chǎn)生分泌高水平特異性Ig G2a。在這些特異性免疫因子的協(xié)同作用下,機體能有效或更有效地殺傷和清除血管內(nèi)皮細胞內(nèi)寄生的立氏立克次體。本研究為落基山斑點熱亞單位疫苗的研發(fā)提供新的候選抗原分子,同時也為研究立氏立克次體致病機制揭示了潛在致病分子。另外,CMR-C與r Omp B-4聯(lián)合免疫為研發(fā)抗立氏立克次體和抗貝氏柯克斯體感染的雙效疫苗提供一種新的思路。
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【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392

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本文編號：2284306