發(fā)布時間：2021-03-20 19:56

  NK細胞是天然免疫系統(tǒng)中具有抗腫瘤和抗病毒功能的重要效應細胞。在病毒感染早期,NK細胞快速應答殺傷被感染靶細胞。NK細胞發(fā)育分化、發(fā)揮功能等過程受到多種細胞因子的調控。在誘導小鼠骨髓前體細胞發(fā)育分化體系中,SCF、IL-7、FLT31和IL-15被證明具有促進NK細胞發(fā)育分化的功能。而體內細胞因子網(wǎng)絡更為復雜,能夠明確某一細胞因子對NK細胞的作用是十分重要的。關于細胞因子的功能研究一般依賴細胞因子或其受體的基因缺陷小鼠,從中可以了解細胞因子在某些細胞亞群發(fā)育及功能上的作用。但是有時因代償作用,細胞因子信號途徑的缺失并不會引起任何變化。對小鼠給予外源細胞因子的補充是另一種研究思路,該方法可以明確當體內某種細胞因子含量升高時,對某細胞亞群的發(fā)育及功能的影響。但是通常細胞因子半衰期較短,需連續(xù)給藥,操作復雜,經(jīng)濟成本高。為此,我們構建了免疫系統(tǒng)人源化小鼠以及人IL-21和鼠IL-28B兩種細胞因子過表達載體,通過高壓注射的方式將載體導入小鼠肝細胞內,實現(xiàn)體內細胞因子的持續(xù)供給。在此基礎上,分別研究兩種細胞因子對人NK細胞和小鼠NK細胞發(fā)育分化的影響。1.過表達hIL-21促進人源化小鼠中NK細胞的發(fā)育分化免疫系統(tǒng)人源化小鼠是指在免疫缺陷小鼠中,植入人的造血細胞、淋巴細胞或組織而使其具有人的免疫系統(tǒng)的小鼠模型。經(jīng)過三十幾年的不斷改進,人源化小鼠模型已日益完善,但是在已有的人源化小鼠模型中,人NK細胞的重建仍是一大難題。當受者小鼠的自身免疫功能過強時,人源NK細胞難以重建,而當受者小鼠的自身免疫功能進一步缺陷,人NK細胞重建水平只得到微弱提高。當外源給予hIL-15時,往往重建的NK細胞比例超過生理水平,導致細胞組成失調。圍繞著如何建立一個具有生理水平NK細胞的理想人源化小鼠模型,我們開展了一系列研究工作,主要結果如下:1)我們采用人外周血單個核細胞轉輸給T細胞、B細胞缺陷的NOD/SCID小鼠進行人源化免疫系統(tǒng)重建。結果發(fā)現(xiàn),雖然在小鼠各臟器中可以檢測到較高比例的人源免疫細胞,但是僅表現(xiàn)為人源免疫細胞的直接植入,而沒有由人源造血干細胞的發(fā)育分化而來的免疫細胞。2)由于人外周血單個核細胞中造血干細胞的比例較低,由造血干細胞發(fā)育分化出免疫細胞的概率較低。為此,我們采用臍帶血造血干細胞為供者細胞,轉輸給NOD/SCID小鼠進行人源化免疫系統(tǒng)重建。結果發(fā)現(xiàn),小鼠各臟器中均重建出較高比例的人源免疫細胞,但是T細胞和NK細胞的重建水平較低,揭示受者小鼠中殘存的NK細胞仍是人源化免疫系統(tǒng)重建的障礙。3)為了降低受者鼠NK細胞的影響,我們采用臍帶血造血干細胞轉輸給T細胞、B細胞及NK細胞均缺陷的NOG小鼠。結果表明,與NOD/SCID小鼠相比,免疫系統(tǒng)人源化重建水平顯著提高,重建時間縮短。4)為了使NK細胞能夠在一個模擬人的環(huán)境中發(fā)育分化,我們在NOG小鼠中過表達hIL-21并轉輸臍帶血造血干細胞重建人源化免疫系統(tǒng)。結果發(fā)現(xiàn),hIL-21的持續(xù)表達顯著促進了人源化NK細胞的發(fā)育分化,并且其NK細胞比例與生理狀況相接近。5)進而對免疫系統(tǒng)人源化小鼠進行組織學檢測,發(fā)現(xiàn)人源化免疫細胞在免疫器官中廣泛分布。通過對CD4和CD8分子的檢測及分析,表明人源化T細胞在小鼠胸腺中可以完成陽性選擇。以上結果表明,我們在NOG小鼠中成功構建了人源免疫系統(tǒng),并通過實現(xiàn)hIL-21在小鼠體內的持續(xù)性表達,提高了人源化免疫系統(tǒng)的重建,尤其是促進了人NK細胞的發(fā)育分化。除此之外,人源化T細胞在小鼠的胸腺內能夠完成陽性選擇,發(fā)育為成熟T細胞到達外周。該人源化小鼠模型將為人NK細胞生物學研究提供一個有力的動物模型。2.IL-28B促進小鼠NK細胞的增殖和成熟Ⅲ型干擾素是新近發(fā)現(xiàn)的干擾素家族成員,主要包括IFN-λ1(IL-29),IFN-λ2(IL-28A),IFN-λ3(IL-28B)和IFN-λ4。雖然其下游信號與Ⅰ型干擾素有較大的重疊性,但是在抗病毒感染過程中仍具有特異性。NK細胞是抗病毒感染的主要效應細胞,Ⅲ型干擾素是否具有調控NK細胞的抗病毒功能報道較少,為此我們構建了小鼠IL-28B過表達載體,通過高壓注射實現(xiàn)在小鼠體內持續(xù)性表達IL-28B,進而研究其在NK細胞發(fā)育分化及發(fā)揮功能過程中的調控作用。結果如下:1)首先,我們對高壓注射pLIVE-IL-28b或空載體pLIVE-vector的野生型小鼠脾臟、肝臟及肺臟NK細胞進行了檢測。結果發(fā)現(xiàn),過表達IL-28B系統(tǒng)性地增加了 NK細胞的比例和數(shù)目。通過流式細胞術對小鼠NK細胞的增殖能力進行檢測,結果表明,IL-28B過表達小鼠的脾臟、肝臟和肺臟NK細胞的增殖能力均顯著提高。接著,我們根據(jù)NK細胞表面標志CD11b,CD27以及KLRG1對NK細胞的成熟階段進行劃分,并檢測不同成熟階段NK細胞的比例及增殖能力。結果表明,IL-28B過表達小鼠各臟器中終末成熟階段的NK細胞具有更高的增殖能力。這一部分結果表明,體內過表達IL-28B促進NK細胞增殖和成熟。2)為了探索過表達IL-28B對NK細胞活化狀態(tài)和功能的影響,我們檢測了過表達IL-28B的小鼠脾臟、肝臟及肺臟中NK細胞的表面受體NKG2A/C/E,NKG2D,Ly49CIFH、分泌型分子IFN-y,perforin以及活化性標志CD69的表達情況,與對照組小鼠相比均無顯著性差異,說明體內過表達IL-28B不會引起NK細胞的過度活化和功能增強。3)由于IL-28Rα只表達于有限類型的細胞上,NK細胞能否直接接受IL-28B的信號仍存在爭議。我們發(fā)現(xiàn),在IL-28B過表達小鼠中肺臟NK細胞增加最為顯著,而肺泡巨噬細胞中IL-28Rα的表達水平顯著高于NK細胞。為了研究IL-28B是否通過先作用于巨噬細胞進而影響了 NK細胞的增殖能力,我們對IL-28B過表達小鼠采用氯膦酸鹽脂質體清除巨噬細胞,進而對小鼠脾臟、肝臟及肺臟中NK細胞的比例及不同發(fā)育階段進行了檢測。結果表明,巨噬細胞清除小鼠中,NK細胞比例顯著下降,不成熟階段NK細胞增多而成熟階段NK細胞減少。說明在小鼠體內,巨噬細胞參與了 IL-28B誘導NK細胞增殖和成熟的過程。4)為了進一步確定巨噬細胞與NK細胞的相互作用,我們在體外實驗中用不同濃度的IL-28B對小鼠肺泡巨噬細胞進行刺激,進而將巨噬細胞與CFSE標記的小鼠肺臟NK細胞共孵育,并對NK細胞增殖情況進行檢測。結果表明,IL-28B預刺激的肺泡巨噬細胞具有促進NK細胞增殖的能力,并且具有劑量依賴性。為了研究IL-28B刺激的巨噬細胞與NK細胞之間的作用是否依賴細胞間直接接觸,transwell實驗結果表明,巨噬細胞依然能夠顯著促進NK細胞的增殖,說明IL-28B通過巨噬細胞促進NK細胞的增殖不依賴細胞間直接接觸。5)最后,我們采用鼠肺適應株流感病毒PR8對野生型小鼠進行滴鼻感染,并檢測其肺臟IL-28的表達情況。結果表明,流感病毒感染小鼠的肺臟IL-28基因及蛋白水平的表達均顯著升高。在流感病毒PR8感染模型中,體內過表達IL-28B組小鼠的生存率顯著提高,體重下降速率減緩,病理損傷情況明顯減輕,均提示IL-28B對PR8毒株的感染具有保護性作用。在NK細胞缺陷鼠Nfil3-/-小鼠中,過表達IL-28B對流感病毒感染具有一定的保護性作用,但是保護效果與野生型小鼠相比較差。說明當NK細胞缺陷時,IL-28B的保護性功能受損,揭示NK細胞參與了 IL-28B保護流感病毒感染小鼠的過程中。以上結果表明,體內過表達IL-28B可以系統(tǒng)性地促進NK細胞增殖和成熟,而這一過程是巨噬細胞依賴的。在鼠肺適應株流感病毒PR8滴鼻感染小鼠模型中,過表達IL-28B對小鼠具有保護性作用,一方面歸因于其自身抗病毒功能,另一方面則由于誘導產生更多成熟的NK細胞,二者協(xié)同作用抵御病毒感染。更好地了解IL-28B的生物學特性,對其臨床應用具有重要的指導意義。
【學位授予單位】：中國科學技術大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R392

【參考文獻】

相期刊論文 前1條

1 ;Human Prolactin Improves Engraftment and Reconstitution of Human Peripheral Blood Lymphocytes in SCID Mice[J];Cellular & Molecular Immunology;2004年02期

 

本文編號：2268456