NK細(xì)胞是天然免疫系統(tǒng)中具有抗腫瘤和抗病毒功能的重要效應(yīng)細(xì)胞。在病毒感染早期,NK細(xì)胞快速應(yīng)答殺傷被感染靶細(xì)胞。NK細(xì)胞發(fā)育分化、發(fā)揮功能等過(guò)程受到多種細(xì)胞因子的調(diào)控。在誘導(dǎo)小鼠骨髓前體細(xì)胞發(fā)育分化體系中,SCF、IL-7、FLT31和IL-15被證明具有促進(jìn)NK細(xì)胞發(fā)育分化的功能。而體內(nèi)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)更為復(fù)雜,能夠明確某一細(xì)胞因子對(duì)NK細(xì)胞的作用是十分重要的。關(guān)于細(xì)胞因子的功能研究一般依賴細(xì)胞因子或其受體的基因缺陷小鼠,從中可以了解細(xì)胞因子在某些細(xì)胞亞群發(fā)育及功能上的作用。但是有時(shí)因代償作用,細(xì)胞因子信號(hào)途徑的缺失并不會(huì)引起任何變化。對(duì)小鼠給予外源細(xì)胞因子的補(bǔ)充是另一種研究思路,該方法可以明確當(dāng)體內(nèi)某種細(xì)胞因子含量升高時(shí),對(duì)某細(xì)胞亞群的發(fā)育及功能的影響。但是通常細(xì)胞因子半衰期較短,需連續(xù)給藥,操作復(fù)雜,經(jīng)濟(jì)成本高。為此,我們構(gòu)建了免疫系統(tǒng)人源化小鼠以及人IL-21和鼠IL-28B兩種細(xì)胞因子過(guò)表達(dá)載體,通過(guò)高壓注射的方式將載體導(dǎo)入小鼠肝細(xì)胞內(nèi),實(shí)現(xiàn)體內(nèi)細(xì)胞因子的持續(xù)供給。在此基礎(chǔ)上,分別研究?jī)煞N細(xì)胞因子對(duì)人NK細(xì)胞和小鼠NK細(xì)胞發(fā)育分化的影響。1.過(guò)表達(dá)hIL-21促進(jìn)人源化小鼠中NK細(xì)胞的發(fā)育分化免疫系統(tǒng)人源化小鼠是指在免疫缺陷小鼠中,植入人的造血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞或組織而使其具有人的免疫系統(tǒng)的小鼠模型。經(jīng)過(guò)三十幾年的不斷改進(jìn),人源化小鼠模型已日益完善,但是在已有的人源化小鼠模型中,人NK細(xì)胞的重建仍是一大難題。當(dāng)受者小鼠的自身免疫功能過(guò)強(qiáng)時(shí),人源NK細(xì)胞難以重建,而當(dāng)受者小鼠的自身免疫功能進(jìn)一步缺陷,人NK細(xì)胞重建水平只得到微弱提高。當(dāng)外源給予hIL-15時(shí),往往重建的NK細(xì)胞比例超過(guò)生理水平,導(dǎo)致細(xì)胞組成失調(diào)。圍繞著如何建立一個(gè)具有生理水平NK細(xì)胞的理想人源化小鼠模型,我們開(kāi)展了一系列研究工作,主要結(jié)果如下:1)我們采用人外周血單個(gè)核細(xì)胞轉(zhuǎn)輸給T細(xì)胞、B細(xì)胞缺陷的NOD/SCID小鼠進(jìn)行人源化免疫系統(tǒng)重建。結(jié)果發(fā)現(xiàn),雖然在小鼠各臟器中可以檢測(cè)到較高比例的人源免疫細(xì)胞,但是僅表現(xiàn)為人源免疫細(xì)胞的直接植入,而沒(méi)有由人源造血干細(xì)胞的發(fā)育分化而來(lái)的免疫細(xì)胞。2)由于人外周血單個(gè)核細(xì)胞中造血干細(xì)胞的比例較低,由造血干細(xì)胞發(fā)育分化出免疫細(xì)胞的概率較低。為此,我們采用臍帶血造血干細(xì)胞為供者細(xì)胞,轉(zhuǎn)輸給NOD/SCID小鼠進(jìn)行人源化免疫系統(tǒng)重建。結(jié)果發(fā)現(xiàn),小鼠各臟器中均重建出較高比例的人源免疫細(xì)胞,但是T細(xì)胞和NK細(xì)胞的重建水平較低,揭示受者小鼠中殘存的NK細(xì)胞仍是人源化免疫系統(tǒng)重建的障礙。3)為了降低受者鼠NK細(xì)胞的影響,我們采用臍帶血造血干細(xì)胞轉(zhuǎn)輸給T細(xì)胞、B細(xì)胞及NK細(xì)胞均缺陷的NOG小鼠。結(jié)果表明,與NOD/SCID小鼠相比,免疫系統(tǒng)人源化重建水平顯著提高,重建時(shí)間縮短。4)為了使NK細(xì)胞能夠在一個(gè)模擬人的環(huán)境中發(fā)育分化,我們?cè)贜OG小鼠中過(guò)表達(dá)hIL-21并轉(zhuǎn)輸臍帶血造血干細(xì)胞重建人源化免疫系統(tǒng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),hIL-21的持續(xù)表達(dá)顯著促進(jìn)了人源化NK細(xì)胞的發(fā)育分化,并且其NK細(xì)胞比例與生理狀況相接近。5)進(jìn)而對(duì)免疫系統(tǒng)人源化小鼠進(jìn)行組織學(xué)檢測(cè),發(fā)現(xiàn)人源化免疫細(xì)胞在免疫器官中廣泛分布。通過(guò)對(duì)CD4和CD8分子的檢測(cè)及分析,表明人源化T細(xì)胞在小鼠胸腺中可以完成陽(yáng)性選擇。以上結(jié)果表明,我們?cè)贜OG小鼠中成功構(gòu)建了人源免疫系統(tǒng),并通過(guò)實(shí)現(xiàn)hIL-21在小鼠體內(nèi)的持續(xù)性表達(dá),提高了人源化免疫系統(tǒng)的重建,尤其是促進(jìn)了人NK細(xì)胞的發(fā)育分化。除此之外,人源化T細(xì)胞在小鼠的胸腺內(nèi)能夠完成陽(yáng)性選擇,發(fā)育為成熟T細(xì)胞到達(dá)外周。該人源化小鼠模型將為人NK細(xì)胞生物學(xué)研究提供一個(gè)有力的動(dòng)物模型。2.IL-28B促進(jìn)小鼠NK細(xì)胞的增殖和成熟Ⅲ型干擾素是新近發(fā)現(xiàn)的干擾素家族成員,主要包括IFN-λ1(IL-29),IFN-λ2(IL-28A),IFN-λ3(IL-28B)和IFN-λ4。雖然其下游信號(hào)與Ⅰ型干擾素有較大的重疊性,但是在抗病毒感染過(guò)程中仍具有特異性。NK細(xì)胞是抗病毒感染的主要效應(yīng)細(xì)胞,Ⅲ型干擾素是否具有調(diào)控NK細(xì)胞的抗病毒功能報(bào)道較少,為此我們構(gòu)建了小鼠IL-28B過(guò)表達(dá)載體,通過(guò)高壓注射實(shí)現(xiàn)在小鼠體內(nèi)持續(xù)性表達(dá)IL-28B,進(jìn)而研究其在NK細(xì)胞發(fā)育分化及發(fā)揮功能過(guò)程中的調(diào)控作用。結(jié)果如下:1)首先,我們對(duì)高壓注射pLIVE-IL-28b或空載體pLIVE-vector的野生型小鼠脾臟、肝臟及肺臟NK細(xì)胞進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)IL-28B系統(tǒng)性地增加了 NK細(xì)胞的比例和數(shù)目。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)小鼠NK細(xì)胞的增殖能力進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,IL-28B過(guò)表達(dá)小鼠的脾臟、肝臟和肺臟NK細(xì)胞的增殖能力均顯著提高。接著,我們根據(jù)NK細(xì)胞表面標(biāo)志CD11b,CD27以及KLRG1對(duì)NK細(xì)胞的成熟階段進(jìn)行劃分,并檢測(cè)不同成熟階段NK細(xì)胞的比例及增殖能力。結(jié)果表明,IL-28B過(guò)表達(dá)小鼠各臟器中終末成熟階段的NK細(xì)胞具有更高的增殖能力。這一部分結(jié)果表明,體內(nèi)過(guò)表達(dá)IL-28B促進(jìn)NK細(xì)胞增殖和成熟。2)為了探索過(guò)表達(dá)IL-28B對(duì)NK細(xì)胞活化狀態(tài)和功能的影響,我們檢測(cè)了過(guò)表達(dá)IL-28B的小鼠脾臟、肝臟及肺臟中NK細(xì)胞的表面受體NKG2A/C/E,NKG2D,Ly49CIFH、分泌型分子IFN-y,perforin以及活化性標(biāo)志CD69的表達(dá)情況,與對(duì)照組小鼠相比均無(wú)顯著性差異,說(shuō)明體內(nèi)過(guò)表達(dá)IL-28B不會(huì)引起NK細(xì)胞的過(guò)度活化和功能增強(qiáng)。3)由于IL-28Rα只表達(dá)于有限類型的細(xì)胞上,NK細(xì)胞能否直接接受IL-28B的信號(hào)仍存在爭(zhēng)議。我們發(fā)現(xiàn),在IL-28B過(guò)表達(dá)小鼠中肺臟NK細(xì)胞增加最為顯著,而肺泡巨噬細(xì)胞中IL-28Rα的表達(dá)水平顯著高于NK細(xì)胞。為了研究IL-28B是否通過(guò)先作用于巨噬細(xì)胞進(jìn)而影響了 NK細(xì)胞的增殖能力,我們對(duì)IL-28B過(guò)表達(dá)小鼠采用氯膦酸鹽脂質(zhì)體清除巨噬細(xì)胞,進(jìn)而對(duì)小鼠脾臟、肝臟及肺臟中NK細(xì)胞的比例及不同發(fā)育階段進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明,巨噬細(xì)胞清除小鼠中,NK細(xì)胞比例顯著下降,不成熟階段NK細(xì)胞增多而成熟階段NK細(xì)胞減少。說(shuō)明在小鼠體內(nèi),巨噬細(xì)胞參與了 IL-28B誘導(dǎo)NK細(xì)胞增殖和成熟的過(guò)程。4)為了進(jìn)一步確定巨噬細(xì)胞與NK細(xì)胞的相互作用,我們?cè)隗w外實(shí)驗(yàn)中用不同濃度的IL-28B對(duì)小鼠肺泡巨噬細(xì)胞進(jìn)行刺激,進(jìn)而將巨噬細(xì)胞與CFSE標(biāo)記的小鼠肺臟NK細(xì)胞共孵育,并對(duì)NK細(xì)胞增殖情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明,IL-28B預(yù)刺激的肺泡巨噬細(xì)胞具有促進(jìn)NK細(xì)胞增殖的能力,并且具有劑量依賴性。為了研究IL-28B刺激的巨噬細(xì)胞與NK細(xì)胞之間的作用是否依賴細(xì)胞間直接接觸,transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,巨噬細(xì)胞依然能夠顯著促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖,說(shuō)明IL-28B通過(guò)巨噬細(xì)胞促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖不依賴細(xì)胞間直接接觸。5)最后,我們采用鼠肺適應(yīng)株流感病毒PR8對(duì)野生型小鼠進(jìn)行滴鼻感染,并檢測(cè)其肺臟IL-28的表達(dá)情況。結(jié)果表明,流感病毒感染小鼠的肺臟IL-28基因及蛋白水平的表達(dá)均顯著升高。在流感病毒PR8感染模型中,體內(nèi)過(guò)表達(dá)IL-28B組小鼠的生存率顯著提高,體重下降速率減緩,病理?yè)p傷情況明顯減輕,均提示IL-28B對(duì)PR8毒株的感染具有保護(hù)性作用。在NK細(xì)胞缺陷鼠Nfil3-/-小鼠中,過(guò)表達(dá)IL-28B對(duì)流感病毒感染具有一定的保護(hù)性作用,但是保護(hù)效果與野生型小鼠相比較差。說(shuō)明當(dāng)NK細(xì)胞缺陷時(shí),IL-28B的保護(hù)性功能受損,揭示NK細(xì)胞參與了 IL-28B保護(hù)流感病毒感染小鼠的過(guò)程中。以上結(jié)果表明,體內(nèi)過(guò)表達(dá)IL-28B可以系統(tǒng)性地促進(jìn)NK細(xì)胞增殖和成熟,而這一過(guò)程是巨噬細(xì)胞依賴的。在鼠肺適應(yīng)株流感病毒PR8滴鼻感染小鼠模型中,過(guò)表達(dá)IL-28B對(duì)小鼠具有保護(hù)性作用,一方面歸因于其自身抗病毒功能,另一方面則由于誘導(dǎo)產(chǎn)生更多成熟的NK細(xì)胞,二者協(xié)同作用抵御病毒感染。更好地了解IL-28B的生物學(xué)特性,對(duì)其臨床應(yīng)用具有重要的指導(dǎo)意義。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相期刊論文 前1條

1 ;Human Prolactin Improves Engraftment and Reconstitution of Human Peripheral Blood Lymphocytes in SCID Mice[J];Cellular & Molecular Immunology;2004年02期

 

本文編號(hào)：2268456