發(fā)布時間：2018-08-24 13:14

【摘要】：目的構建帶FLAG標簽的半胱氨酸和甘氨酸富集蛋白1(CRP1)的真核表達載體,明確該融合蛋白在人胚腎293T細胞、肝癌HepG2細胞和乳腺癌ZR75-1細胞中的表達及定位情況。方法采用PCR技術從乳腺cDNA文庫中擴增出人CRP1基因,并將其插入到pCMV-Tag2B表達載體中;將重組質粒轉染人胚腎293T細胞、肝癌HepG2細胞、乳腺癌ZR75-1細胞,Western blot法檢測轉染細胞的表達情況;熒光顯微鏡觀察pCMV-FLAG-CRP1在人胚腎293T細胞、肝癌HepG2細胞、乳腺癌ZR75-1細胞中的定位。結果雙酶切和測序鑒定表明,pCMV-FLAG-CRP1真核表達質粒構建成功;Western blot法檢測pCMV-FLAG-CRP1轉染293T細胞、肝癌HepG2細胞、乳腺癌ZR75-1細胞后成功表達;熒光顯微鏡下觀察,在293T、HepG2、ZR75-1細胞中,CRP1在細胞質和細胞核中均有分布,且胞質信號強于胞核。結論成功構建pCMV-FLAG-CRP1真核表達載體,CRP1可在不同細胞中的胞質和胞核表達。
[Abstract]:Objective to construct the eukaryotic expression vector of cysteine and glycine enriched protein 1 (CRP1) labeled with FLAG, and to determine the expression and localization of the fusion protein in 293T cells of human embryonic kidney, HepG2 cells of liver cancer and ZR75-1 cells of breast cancer. Methods Human CRP1 gene was amplified by PCR from mammary gland cDNA library and inserted into pCMV-Tag2B expression vector. The recombinant plasmid was transfected into 293T cells of human embryonic kidney, HepG2 cells of liver cancer and ZR75-1 cells of breast cancer. The localization of pCMV-FLAG-CRP1 in 293T cells of human embryonic kidney, HepG2 cells of liver cancer and ZR75-1 cells of breast cancer was observed by fluorescence microscope. Results double enzyme digestion and sequencing showed that pCMV-FLAG-CRP1 eukaryotic expression plasmid was successfully constructed to detect the expression of pCMV-FLAG-CRP1 in 293T cells, hepatocarcinoma HepG2 cells and breast cancer ZR75-1 cells by Western blot assay. CRP1 was distributed in the cytoplasm and nucleus of 293T HepG2G 2 + ZR75-1 cells, and the cytoplasmic signal was stronger than that in the nucleus. Conclusion pCMV-FLAG-CRP1 eukaryotic expression vector can be successfully constructed to express cytoplasm and nucleus in different cells.
【作者單位】： 軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所;解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院腫瘤一科;解放軍總醫(yī)院內分泌科;
【基金】：國家自然科學基金(30872939,31100604,81101065)
【分類號】：R346

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本文編號：2200928