【摘要】：背景：單純皰疹病毒(Herpes simplex virus,HSV)通過破損的皮膚或粘膜侵入人體,引起角膜皰疹、病毒性腦炎、生殖道皰疹等多種感染,嚴(yán)重感染可致失明或死亡,并可在機(jī)體內(nèi)終身潛伏,伴隨無癥狀或有癥狀的周期性復(fù)發(fā),其人群感染率高達(dá)60%~95%,造成較嚴(yán)重的疾病負(fù)擔(dān)。目前常用的化學(xué)核苷類似物不能有效抑制HSV病毒的感染,探求有效抗HSV感染的治療方法具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)攜帶干擾素γ(Interferon-γ,IFN-γ)的HSV擴(kuò)增子載體經(jīng)顱內(nèi)局部注射給藥后表現(xiàn)了較好的靶向抗HSV作用。傳統(tǒng)研究采用了質(zhì)粒型HSV擴(kuò)增子載體,研究發(fā)現(xiàn)其骨架上的細(xì)菌元件可抑制外源基因的表達(dá),而去除細(xì)菌元件后的小環(huán)狀擴(kuò)增子可以介導(dǎo)外源基因的長期穩(wěn)定表達(dá)。整合酶ФC31介導(dǎo)的細(xì)菌內(nèi)重組可產(chǎn)生小環(huán)狀擴(kuò)增子,但存在費(fèi)時(shí)、入門質(zhì)粒載體污染等問題。本實(shí)驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn)雙腺病毒載體可在體外培養(yǎng)的真核細(xì)胞內(nèi)通過Cre-loxp重組產(chǎn)生小環(huán)狀擴(kuò)增子,并可被輔助病毒包裝形成假病毒,該重組方法省時(shí)省力、提高了小環(huán)狀擴(kuò)增子的產(chǎn)率。目的:目的：本研究擬觀察雙腺病毒載體能否在體內(nèi)粘膜上皮細(xì)胞中通過Cre-loxp重組產(chǎn)生小環(huán)狀擴(kuò)增子,以及其攜帶的IFN-γ的抗HSV-2療效。方法:1.體外細(xì)胞內(nèi)重組:借助于LR重組技術(shù)構(gòu)建啟動子與報(bào)告基因編碼序列同向分別置于HSV病毒基因元件復(fù)制起始Ori S與包裝信號Pac的兩端的兩種腺病毒Adv-loxp-DOPCp-loxp與Adv-loxp-LOPCp-loxp,兩者分別攜帶一種報(bào)告基因(表達(dá)紅色熒光的Ds Red基因與表達(dá)β-半乳糖苷酶的Lac Z基因),分別與表達(dá)Cre酶的Adv-Cre共感染2-2細(xì)胞,通過觀察報(bào)告基因的表達(dá)及PCR的方法驗(yàn)證體外培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)是否重組產(chǎn)生小環(huán)狀擴(kuò)增子。2.體內(nèi)粘膜上皮細(xì)胞內(nèi)重組:將上述構(gòu)建的Adv-loxp-DOPCp-loxp與Adv-loxp-LOPCp-loxp,分別與Adv-Cre按相同MOI接種急性HSV感染生殖道模型小鼠的生殖道,感染后收集陰道灌洗液,通過PCR、病毒培養(yǎng)觀察熒光或粘膜組織切片β-半乳糖苷酶原位染色等方式確定粘膜上皮內(nèi)是否形成小環(huán)狀擴(kuò)增子假病毒。3.粘膜重組小環(huán)狀擴(kuò)增子的抗HSV-2效應(yīng):采用同樣的方法構(gòu)建Adv-loxp-IRDOPCp-loxp(IFN-γ與Ds Red雙基因表達(dá)盒),與Adv-Cre按相同MOI接種體外培養(yǎng)細(xì)胞或急性HSV感染生殖道模型小鼠的生殖道。體外細(xì)胞培養(yǎng)通過觀察紅色熒光蛋白表達(dá)與ELISA方法檢測m IFNγ的方法驗(yàn)證表達(dá)IFN-γ與Ds Red的小環(huán)狀擴(kuò)增子是否構(gòu)建成功。體內(nèi)粘膜重組形成的表達(dá)IFN-γ的小環(huán)狀擴(kuò)增子被包成假病毒,其發(fā)揮的抗HSV-2作用通過觀察急性HSV-2感染期小鼠存活率的方法進(jìn)行研究。結(jié)果:1.體外細(xì)胞內(nèi)重組:雙腺病毒Adv-Cre與Adv-loxp-DOPCp-loxp(或Adv-loxp-LOPCp-loxp)感染2-2細(xì)胞后出現(xiàn)廣泛的紅色熒光表達(dá)(或β-半乳糖苷酶原位染色可見細(xì)胞藍(lán)染),PCR擴(kuò)增可得相應(yīng)的目的條帶,證明細(xì)胞內(nèi)重組產(chǎn)生小環(huán)狀擴(kuò)增子。復(fù)制缺陷性病毒HSV-1 del ICP27輔助上述小環(huán)狀擴(kuò)增子包裝得到含小環(huán)狀擴(kuò)增子假病毒與輔助病毒的混合病毒。2.體內(nèi)粘膜上皮細(xì)胞內(nèi)重組:急性期HSV小鼠生殖道感染模型建立,通過觀察存活期的感染癥狀和生殖道粘膜組織HE染色的方法可證實(shí)。上述模型構(gòu)建成功后經(jīng)生殖道給予Adv-Cre與Adv-loxp-DOPCp-loxp(或Adv-loxp-LOPCp-loxp),陰道灌洗液PCR擴(kuò)增得到目的條帶。病毒分離培養(yǎng)或組織β-半乳糖苷酶原位染色陽性可見小環(huán)狀擴(kuò)增子形成假病毒,并隨著HSV病毒而復(fù)制。3.粘膜重組小環(huán)狀擴(kuò)增子的抗HSV-2作用:Adv-Cre與Adv-loxp-IRDOPCp-loxp共感染2-2細(xì)胞,復(fù)制缺陷病毒株HSV-1 del ICP27輔助包裝形成小環(huán)狀擴(kuò)增子MC-OPIRD假病毒,出現(xiàn)CPE病變,伴紅色熒光蛋白的表達(dá),ELISA檢測IFN-γ的表達(dá)。體內(nèi)結(jié)果顯示重組小環(huán)狀擴(kuò)增子病毒介導(dǎo)的m IFN-γ體內(nèi)粘膜表達(dá)量顯著高于對照組(p0.01),急性感染期小鼠存活分析顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠生存率高于對照組(p0.01)。結(jié)論:雙腺病毒可在粘膜上皮內(nèi)通過Cre-loxp重組產(chǎn)生小環(huán)狀擴(kuò)增子,并依賴于粘膜內(nèi)已感染的HSV包裝形成假病毒。表達(dá)干擾素γ的小環(huán)狀擴(kuò)增子對急性期粘膜單純皰疹病毒感染可以起到抑制作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R373.11

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本文編號：2200507