【摘要】：[背景目的] 結(jié)核病(TB)亞單位蛋白疫苗,與卡介苗(BCG)和其它類型的疫苗相比,更具安全性。目前,已經(jīng)提出不同策略發(fā)展亞單位蛋白疫苗,并且有五種亞單位蛋白疫苗臨床試驗(yàn)。為了發(fā)展更加有效的、建立在細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答為基礎(chǔ)的TB亞單位蛋白疫苗,本文擬構(gòu)建包含結(jié)核分枝桿菌(Mycobaterium tuberculosis, M. tb)5個(gè)具有CD8+T細(xì)胞表位的抗原,即CFP10, TB10.4, TB8.4, Rv3615c和HBHA的融合蛋白CTT3H。原核表達(dá)和純化該蛋白,建立TB亞單位蛋白侯選疫苗CTT3H/DMT佐劑(DDA/MPL/TDB),并評(píng)價(jià)了其免疫原性和保護(hù)性。 [方法] 1.菌株及其培養(yǎng)：BCG和M. tb H37Rv用7H9或7H11培養(yǎng)基(補(bǔ)充10%ADC,0.5%甘油和0.05%吐溫80)培養(yǎng)；E.coli DH5a菌株和BL21(DE3)菌株用LB固體或液體培養(yǎng)基培養(yǎng),分別用于克隆和表達(dá)。 2.融合蛋白CTT3H的構(gòu)建表達(dá)、純化和SDS-PAGE和Western blotting鑒定。 3.薄膜法制備亞單位蛋白疫苗CTT3H/DMT:DMT佐劑(100μL/dose)包含250μg DDA,和50μg TDB。先用薄膜法制備DMT佐劑,然后將DMT佐劑與融合蛋白CTT3H混合均勻。200gL亞單位蛋白疫苗CTT3H/DMT包含100μL DMT和100μL融合蛋白CTT3H (20μg)。 4.評(píng)價(jià)亞單位蛋白疫苗CTT3H/DMT抗M. tb H37Rv感染保護(hù)性(n=6)：SPF級(jí)6-8周齡C57BL/6雌性小鼠,皮下給予0.2mL亞單位蛋白疫苗CTT3H/DMT作為實(shí)驗(yàn)組,免疫兩次,間隔3周；BCG (1.2x10~6CFU/200μL/只)作為陽(yáng)性對(duì)照組；PBS作為陰性對(duì)照組(200μL/只)：DMT佐劑為佐劑對(duì)照組(100μL PBS+100μL DMT/只)。木次免疫C57BL/6小鼠3周后,氣溶膠方式感染60CFU M. tb H37Rv毒株。感染4周后,分別檢測(cè)小鼠脾、肺臟的細(xì)菌載量和病理改變。 5.評(píng)價(jià)亞單位蛋白疫苗CTT3H/DMT的細(xì)胞免疫應(yīng)答：免疫C57BL/6小鼠方式同上,末次免疫后3周,收集脾細(xì)胞。 1) ELISA檢測(cè)CTT3H特異的IFN-y, RPMI1640為陰性對(duì)照,以PPD刺激為陽(yáng)性對(duì)照(n=3)。 2)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法分析CTT3H特異的CD4+和CD8+T細(xì)胞中分泌TNF-a~+、IFN-γ~+、IL-2~+的細(xì)胞總數(shù)。RPMI1640為陰性對(duì)照,以PPD刺激為陽(yáng)性對(duì)照(n=3)。 3) CFSE標(biāo)記法檢測(cè)體內(nèi)TB10.4肽特異的CD8+T細(xì)胞CTL效應(yīng)(n=3)。 6.評(píng)價(jià)亞單位蛋白疫苗CTT3H/DMT的體液免疫應(yīng)答(n=3)：ELISA檢測(cè)小鼠血清中CTT3H特異的抗體總IgG及亞類IgG1、 IgG2c (結(jié)果分析時(shí)用IgG2a代替)的水平。 7.使用SPSS18.0軟件和單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較,p0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 [結(jié)果] 1.融合蛋白CTT3H大小為61kDa,被成功表達(dá)、純化和鑒定。 2.亞單位蛋白疫苗CTT3H/DMT抗M. tb H37Rv原發(fā)感染的保護(hù)性：所有組中,PBS組的脾、肺臟的荷菌量均最高(p0.05),組織病理學(xué)最嚴(yán)重,抗酸染色陽(yáng)性菌遍布小鼠的肺部,并在實(shí)變區(qū)發(fā)現(xiàn)大量抗酸菌。亞單位蛋白疫苗CTT3H/DMT組脾、肺臟與PBS組和單獨(dú)佐劑組相比,可有效的抑制Mbtb的生長(zhǎng),零星的肉芽腫樣實(shí)變區(qū)域,且M.tb較少。亞單位蛋白疫苗CTT3H/DMT組織病理評(píng)分與BCG相當(dāng)。 3.亞單位蛋白疫苗CTT3H/DMT誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答： 1)PBS組僅產(chǎn)生低水平PPD或CTT3H特異的IFN-y水平。BCG組誘導(dǎo)最高水平PPD特異的IFN-y水平(p0.05)。亞單位蛋白疫苗CTT3H/DMT組PPD和CTT3H特異的IFN-y水平顯著高于PBS組和DMT佐劑組(p0.05)。 2)與PBS組和DMT佐劑相比,BCG和亞單位蛋白疫苗CTT3H/DMT誘導(dǎo)產(chǎn)生更高水平PPD或CTT3H特異的IFN-γ~+或IL-2~+CD4~+和CD8+T細(xì)胞以及TNF-α~+CD4~+T細(xì)胞(p0.05)。尤其是,與BCG相比,亞單位蛋白疫苗CTT3H/DMT組產(chǎn)生更高水平PPD或CTT3H特異的IFN-γ~+或TNF-a+CD4+和CD8+T細(xì)胞(p0.05)。另外,BCG組抗原特異的IL-2+CD4+和CD8+T細(xì)胞水平與亞單位蛋白疫苗CTT3H/DMT組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3)BCG組和DMT佐劑組的殺傷率低于亞單位蛋白疫苗CTT3H/DMT組(p0.05)。 4.亞單位蛋白疫苗CTT3H/DMT誘導(dǎo)產(chǎn)生CTT3H特異性的體液免疫應(yīng)答：亞單位蛋白疫苗CTT3H/DMT組CTT3H特異的IgG,IgGl或IgG2a抗體水平最高(p0.05)。BCG組CTT3H特異的抗體水平較低。DMT佐劑組未產(chǎn)生CTT3H特異的抗體。僅亞單位蛋白疫苗CTT3H/DMT組IgG2a/IgGl顯著增加,提示IgG亞類轉(zhuǎn)向Thl型反應(yīng)(p0.05)。 [結(jié)論] DMT是一種較為有效的TB亞單位蛋白疫苗候選佐劑。亞單位蛋白疫苗CTT3H/DMT是一種有效的TB候選疫苗。 [背景目的] 盡管BCG作為T(mén)B唯一的預(yù)防疫苗且廣泛推廣應(yīng)用已50余年,但是TB仍然是最嚴(yán)重的感染性疾病之一。亞單位蛋白疫苗是發(fā)展TB新型疫苗的重要策略,相對(duì)于其它類型疫苗或BCG接種免疫缺陷人群,更具安全性,而且還可能取代BCG用于免疫預(yù)防。為了獲得有效的亞單位蛋白疫苗,前期我們依據(jù)不同的策略,已構(gòu)建了四種亞單位蛋白疫苗A1D3R1(Rv3407-PhoY2-Ag85A-Rv2626c-RpfB)/MTO, A1D4(Rv1813-Rv2660c-Rv2623-HspX)/MTO, CTT3H (CFP10-TB10.4-TB8.4-Rv3615c-HBHA)/DMT,和CMFO (CFP32-MTB70-Rv3044-Rv2073c)/DMT(或MTO),分別免疫C57BL/6小鼠,均證實(shí)具有較好的免疫原性,且能提供顯著增強(qiáng)的抗M.tb原發(fā)感染的保護(hù)性,但是保護(hù)性均不及BCG。為了發(fā)展更為有效的亞單位蛋白疫苗,本研究擬將四種融合蛋白(A1D3R1、 A1D4、 CMFO和CTT3H)等比例混合并結(jié)合DMT佐劑,構(gòu)建成新型的包含19個(gè)抗原的TB亞單位蛋白疫苗AACC/DMT,并評(píng)價(jià)其免疫原性和抗M.tb原發(fā)感染的保護(hù)性。 [方法] 1.純化和鑒定融合蛋白A1D3R1、 A1D4、 CMFO和CTT3H。 2.制備亞單位蛋白疫苗AACC/DMT。 3.評(píng)價(jià)亞單位蛋白疫苗AACC/DMT抗M. tb H37Rv原發(fā)感染的保護(hù)性(n=6)：SPF級(jí)6-8周齡C57BL/6雌性小鼠,皮下注射0.2mL亞單位蛋白疫苗AACC/DMT作為實(shí)驗(yàn)組,免疫兩次,間隔3周;BCG(10~6CFU/200μL/只)作為陽(yáng)性對(duì)照組；PBS作為陰性對(duì)照組(200μL/只)。免疫C57BL/6小鼠18周后,氣溶膠方式感染60CFU M. tb H37Rv毒株。感染4周后,分別檢測(cè)感染小鼠脾、肺臟的荷菌量和肺臟病理改變。 4.評(píng)價(jià)亞單位蛋白疫苗AACC/DMT的細(xì)胞免疫應(yīng)答：C57BL/6小鼠及免疫方式同上,初次免疫后9周和18周,分別收集脾細(xì)胞。 1) ELISA檢測(cè)A1D3R1、 A1D4、 CMFO和CTT3H特異的IFN-y, RPMI1640為陰性對(duì)照,以PPD刺激為陽(yáng)性對(duì)照(n=6,初次免疫小鼠9周和18周后各3只)。 2)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法分析A1D3R1、 A1D4、 CMFO和CTT3H特異的CD4+和CD8+T細(xì)胞中分泌IFN-γ~+、IL-2~+的細(xì)胞總數(shù)。RPMI1640為陰性對(duì)照,以PPD刺激為陽(yáng)性對(duì)照(n=6,初次免疫小鼠9周和18周后各3只)。 3) CFSE標(biāo)記法檢測(cè)體內(nèi)TB10.4和Ag85B CD8~+表位肽特異的CTL效應(yīng)(n=6,初次免疫小鼠9周和18周后各3只)。 5.評(píng)價(jià)亞單位蛋白疫苗AACC/DMT的免疫記憶(n=6,初次免疫小鼠9周和18周后各3只)：以CD44.CD62L表達(dá)作為分選標(biāo)志,利用流式細(xì)胞術(shù),分別檢測(cè)A1D3R1、 A1D4、CMFO、CTT3H和PPD特異的TEM(CD62L~(low)CD44~(high)、 T_(CM)(CD62L~(high)CD44~(high)細(xì)胞數(shù)量；結(jié)合胞內(nèi)因子染色法,進(jìn)一步分析TCM細(xì)胞群中分泌IL-2和TEM細(xì)胞群中分泌IFN-y的細(xì)胞數(shù)量。 6.評(píng)價(jià)亞單位蛋白疫苗AACC/DMT的體液免疫應(yīng)答(n=6,初次免疫小鼠9周和18周后各3只)：ELISA檢測(cè)小鼠血清中A1D3R1、 A1D4、 CMFO和CTT3H特異的抗體總IgG及亞類IgG1、 IgG2c(結(jié)果分析時(shí)用IgG2a代替)的水平。 7.使用SPSS18.0軟件和單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較,p0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 [結(jié)果] 1.蛋白純化和鑒定：成功純化A1D3R1、 A1D4、 CMFO和CTT3H四個(gè)融合蛋白。SDS-PAGE電泳和Western blotting進(jìn)一步鑒定其分子量分別為121kDa、105kDa、117kDa和61kDa,與課題組以前的報(bào)道一致。 2.亞單位蛋白疫苗AACC/DMT免疫的抗Mt6原發(fā)感染保護(hù)性：亞單位蛋白疫苗AACC/DMT免疫組,與PBS組相比,可顯著降低M.tb原發(fā)感染小鼠脾、肺臟的荷菌量(p0.05),其脾臟、肺臟荷菌量與BCG組相當(dāng)。特別是亞單位蛋白疫苗AACC/DMT免疫能提供比BCG組更輕的肺臟病理學(xué)改變。 3.亞單位蛋白疫苗AACC/DMT誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答： 1)與PBS組相比,亞單位蛋白疫苗AACC/DMT誘導(dǎo)免疫小鼠脾細(xì)胞分泌高水平且持久升高的A1D3R1、A1D4、 CMFO和CTT3H抗原特異的IFN-7(p0.05)。 2)與PBS組比較,亞單位蛋白疫苗AACC/DMT誘導(dǎo)產(chǎn)生A1D3R1、 A1D4、 CMFO、 CTT3H特異的IFN-γ~+CD4~+T細(xì)胞數(shù)顯著增高,且持久地增加(p0.05)。 3)初次免疫9周后,亞單位蛋白疫苗AACC/DMT免疫誘導(dǎo)較高水平的靶向TB10.4和Ag85B抗原肽的特異性殺傷率,均顯著高于BCG組(p0.05)；初次免疫18周后,亞單位蛋白疫苗AACC/DMT靶向TB10.4和Ag85B抗原肽的特異性殺傷率均顯著降低且低于BCG組(p0.05)。而B(niǎo)CG靶向TB10.4和Ag85B抗原肽的特異性殺傷率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)顯著升高(p0.05) 4.免疫記憶：與PBS組相比,亞單位蛋白疫苗AACC/DMT免疫誘導(dǎo)的A1D3R1、 A1D4特異的CD4~+T_(EM). CD4~+T_(cM)和CD8~+T_(CM)細(xì)胞數(shù)量以及CMFO、 CTT3H和PPD特異的CD8+TCM細(xì)胞數(shù)量顯著增高,且持久地增加(p0.05)；A1D3R1、A1D4、CMFO、 CTT3H特異的IL-2~+CD4~+T_(CM)或IL-2+CD8~+T_(CM)細(xì)胞數(shù)量顯著增高,且持久地增加(p0.05)。 5.體液免疫應(yīng)答：亞單位蛋白疫苗AACC/DMT免疫小鼠能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生A1D3R1、 AlD4、 CMFO和CTT3H特異且持久的Thl型抗體應(yīng)答(p0.05)。 [結(jié)論] TB亞單位蛋白候選疫苗AACC/DMT,提供與BCG相當(dāng)?shù)目筂.tb感染保護(hù)性并減輕肺臟病理改變。因此,AACC/DMT可作為T(mén)B亞單位疫苗的候選疫苗,可進(jìn)一步應(yīng)用于臨床前評(píng)價(jià)和臨床試驗(yàn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2177241