【摘要】：IFITMs是由干擾素刺激基因編碼的Ⅱ型跨膜蛋白,為膜相關(guān)宿主限制因子。該家族成員中的IFITM1、IFITM2和IFITM3為免疫相關(guān)IFITM,在多種組織和細(xì)胞中廣泛表達(dá),參與體內(nèi)多種生理活動(dòng)。自1996年以來,IFITMs抗病毒活性及機(jī)制已成為研究熱點(diǎn)。大量研究表明,IFITMS夠抑制多種囊膜病毒的感染,包括甲型流感病毒、人類免疫缺陷病毒以及新出現(xiàn)的寨卡病毒等。IFITM3作為其家族成員之一,對抑制甲型流感病毒感染發(fā)揮至關(guān)重要的作用。據(jù)報(bào)道,IFITM3可通過干擾網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的病毒-宿主細(xì)胞膜融合過程抑制流感病毒進(jìn)入,但具體機(jī)制尚不清楚。因此,本研究基于Tet-On 3G系統(tǒng),構(gòu)建了含有人IFITM3基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pLVX-TRE3G-IFITM3;并與調(diào)控質(zhì)粒pLVX-Tet3G共轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后48 h用G418和嘌呤霉素進(jìn)行加壓篩選,Dox對獲得的細(xì)胞系進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)鑒定,并進(jìn)行Dox敏感性分析、IFITM3+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)及定位分析。結(jié)果顯示,成功篩選出可誘導(dǎo)表達(dá)人IFITM3的MDCK細(xì)胞系,且IFITM3表達(dá)量與誘導(dǎo)時(shí)間和Dox使用濃度相關(guān);確定Dox工作濃度為2.5μg/mL,誘導(dǎo)12 h時(shí)IFITM3+細(xì)胞數(shù)達(dá)75%以上,且IFITM3在晚期內(nèi)體/溶酶體存在分布;其次,將擴(kuò)增出的流感病毒HA5、HA7和NA9基因分別連接到真核表達(dá)載體pcDNA 3.1上,轉(zhuǎn)染293細(xì)胞鑒定IFITM3的表達(dá)。然后利用本課題組優(yōu)化建立的第三代慢病毒包裝質(zhì)粒系統(tǒng),制備了以攜帶螢光素酶報(bào)告基因的HA5和HA7為外膜的假型病毒顆粒(H5N9pv-Luc,H7N9pv-Luc),通過螢光素酶活性及感染實(shí)驗(yàn)檢測其感染性。結(jié)果顯示,HA5、HA7和NA9轉(zhuǎn)染后在細(xì)胞內(nèi)可有效表達(dá)且包裝獲得的假型病毒具有感染活性�；谝陨涎芯炕A(chǔ),以H5N9pv-Luc或H7N9pv-Luc及H5N1禽流感病毒為感染模型,分別利用siRNA干擾、螢光素酶分析、自行建立的禽流感病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法、熒光分子標(biāo)記病毒及流式細(xì)胞術(shù)等方法進(jìn)行病毒感染、進(jìn)入及融合實(shí)驗(yàn)研究,從正反兩方面證實(shí)IFITM3抑制流感病毒HA介導(dǎo)的病毒進(jìn)入及膜融合,抑制病毒的復(fù)制及感染。綜上所述,IFITM3對流感病毒HA5和HA7介導(dǎo)的病毒進(jìn)入具有抑制活性,為繼續(xù)探索其中的具體作用機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
[Abstract]:IFITMs is a type 鈪，

本文編號(hào)：2155372