發(fā)布時間：2018-06-14 18:35

  本文選題：樹突狀細胞疫苗 + 納米金　； 參考：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2016年博士論文

【摘要】：背景:樹突狀細胞(Dendritic Cells,DCs)是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁,并且是唯一可以激活幼稚T細胞(Na?ve T Cells)的一類抗原遞呈細胞(Antigen Presenting Cells,APCs)。骨髓或外周血單個核細胞在體外經(jīng)粒細胞-巨噬細胞(GM-CSF)和白細胞介素-4(IL-4)的聯(lián)合刺激下可誘導(dǎo)分化為DCs,這一發(fā)現(xiàn)開啟了過繼性DCs免疫治療的大門。然而,在接受DCs治療的腫瘤或慢性感染性患者中,僅有10 15%的臨床響應(yīng)率。近二十年的研究表明,較低的抗原負載效率和體內(nèi)歸巢能力(5%)是DCs治療失敗的主要原因。因此,如何最大程度提高DCs體外抗原負載效率和體內(nèi)歸巢能力是提高DCs疫苗效果的關(guān)鍵,而該問題解決依賴于新的技術(shù)和方法以優(yōu)化傳統(tǒng)DCs生產(chǎn)和制備工藝,并加強對DCs體內(nèi)生物學(xué)行為的了解和把控。近年來,納米科技方興未艾,各種新型功能化納米材料層出不窮,在多個研究領(lǐng)域顯示出了令人矚目的潛在應(yīng)用價值,生物醫(yī)藥領(lǐng)域也是其中之一。有研究表明,直接注射攜帶有抗原和免疫佐劑的納米材料可顯著提高免疫應(yīng)答作用,然而目前仍有一些問題尚缺乏深入了解,比如,如何通過優(yōu)化納米材料的理化性質(zhì)以調(diào)控過繼性DCs的生物學(xué)效應(yīng)?納米材料負載的DCs在體遷移、歸巢模式及作用機制是什么?納米材料可否通過促進DCs抗原遞呈和調(diào)控DCs的分布以強化DCs疫苗效果?全面認識納米材料與DCs的相互作用規(guī)律及其機制對于開發(fā)新型DCs納米佐劑以加強腫瘤或感染性疾病的治療具有重要意義。目的:針對過繼性DCs疫苗和納米疫苗懸而未決的問題,本研究旨在對功能化金納米載體的理化性質(zhì)進行優(yōu)化,以最大程度提高過繼性DCs疫苗的抗原遞呈效率和成熟程度,對納米佐劑刺激下DCs的在體內(nèi)遷移和歸巢模式進行探討,揭示其作用機制,并最終觀察納米材料所激活在體T細胞免疫應(yīng)答和抗感染疫苗效果。方法及結(jié)果:(1)金納米粒子的制備:采用化學(xué)還原法及種子媒介法制備出10 90 nm范圍的球形、棒狀及立方體金納米粒子(Gold Nanoparticles,AuNPs),并用透射電鏡(Transmission Electron Microscopy,TEM)和表面等離子體共振吸收光譜(Surface Plasmon Resonance,SPR)對所制備納米離子粒徑、形貌和光學(xué)性質(zhì)進行表征。tem結(jié)果顯示所制備納米粒子形態(tài)均勻,粒徑分布在預(yù)期范圍內(nèi),球型納米金粒徑分別約為15nm(aunp15)、30nm(aunp30)、40nm(aunp40)、60nm(aunp60)和80nm(aunp80);棒狀納米金大小約為53nm×25nm(aunr,長徑比2.1);立方體納米金大小為45nm×45nm×45nm(aunc)。spr結(jié)果顯示該幾種納米粒子等離子共振吸收峰分布在400 900nm范圍內(nèi)。(2)金納米粒子的功能化修飾:以ova257-264(ovap)和toll樣受體9(toll-likereceptor9,tlr9)配基cpg-odns分別作為dcs疫苗的模式抗原肽和免疫刺激劑對所制備7種粒徑aunps進行功能化修飾。以殘留熒光值對ovap和cpg-odns的上量和偶聯(lián)效率進行評估,結(jié)果表明90%以上的ovap和cpg-odns可成功以au-s鍵的形式偶聯(lián)于aunps表面;繼而,采用激光粒度儀對修飾后的7種aunps分別在水溶液和1640完全培養(yǎng)基兩種溶劑中行流體力學(xué)半徑和zeta電位測量,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與單純aunps相比,表面修飾ovap的aunps(aunp/ovap)在水溶液中電性質(zhì)發(fā)生反轉(zhuǎn),與帶有正電荷的ovap電性質(zhì)相同;經(jīng)cpg-odns修飾aunps(aunp/cpg-odns)帶有負荷,與cpg-odns電性質(zhì)相同;然而,當修飾后的納米粒子分散于1640培養(yǎng)基中時,由于大量的帶負電荷的血清蛋白的存在,上述兩種功能化納米粒子均帶負電荷。(3)金納米載體的粒徑篩選:將ovap修飾的7種納米粒子分別與dcs在體外共孵育,用流式細胞術(shù)檢測dcs表面mhci與ovap的復(fù)合體,以篩選dcs交叉抗原遞呈效率最高的aunps粒徑和形貌。結(jié)果顯示,與游離抗原肽相比,所有aunps/ovap均可顯著提高dcs抗原遞呈效率,其中以aunp60最優(yōu)。同樣,通過檢測dcs表面共刺激分子和孵育上清中th1類促炎因子(il-12p70、il-1β、il-6和tnf-α)的表達,發(fā)現(xiàn)aunp80/cpg-odns為最優(yōu)cpg-odns納米載體,且其刺激效果與aunp80/cpg-odns的孵育劑量呈正相關(guān)關(guān)系。(4)金納米載體的組合模式及孵育劑量篩選:基于篩選得到載體(aunp60和aunp80),繼續(xù)比較兩種納米載體設(shè)計模式下dcs抗原遞呈和細胞成熟情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),納米金雞尾酒組合模式即nanoau-cocktail(aunp60/ovapaunp80/cpg-odns)優(yōu)于雙功能模式(aunp60/ovap/cpg-odns或aunp80/ovap/cpg-odns),可使dcs同時達到高效的抗原遞呈和細胞成熟度。進一步對nanoau-cocktail與dcs共孵育的劑量進行篩選和優(yōu)化發(fā)現(xiàn),盡管nanoau-cocktail的孵育劑量在12.5-50μg/ml范圍內(nèi)對dcs細胞活性無明顯影響,但中等的nanoau-cocktail孵育劑量(25μg/mlaunp60/ovap和25μg/mlaunp80/cpg-odns)為dcs孵育的最佳劑量。在該劑量下,與“游離ovap/cpg-odns”相比,dcs抗原遞呈效率可提高4-5倍,各th1類炎癥因子亦有4-20倍的提高。tem結(jié)果顯示,被吞噬的aunp60/ovap和aunp80/cpg-odns均定位于dcs溶酶體中。(5)nanoau-cocktail負載的dcs疫苗在體歸巢及分布研究:采用高靈敏生物發(fā)光成像法(bioluminescenceimaging,bli)對nanoau-cocktail負載的dcs在體遷移和分布模式進行探討。結(jié)果顯示,經(jīng)nanoau-cocktail負載后,dcs向淋巴組織歸巢能力明顯提高,在48h時主要聚集在淋巴組織或臟器中;而“游離cpg-odns/ovap”負載的dcs仍有大量滯留在肺臟、肝臟等非淋巴器官。為進一步排除bli在深部組織器官成像靈敏度低的影響,分離小鼠各淋巴臟器和組織器官,體外分析dcs歸巢數(shù)量,結(jié)果發(fā)現(xiàn),肝臟引流淋巴結(jié)(liverdraininglymphnods,llns)是“nanoau-cocktail負載的dcs”聚集最多的淋巴結(jié),占全部淋巴組織歸巢dcs的60%。免疫熒光的結(jié)果進一步確定了該結(jié)果,并發(fā)現(xiàn)歸巢dcs主要定位于淋巴器官的t細胞區(qū)。(6)nanoau-cocktail促進dcs淋巴組織歸巢及機制研究:采用流式細胞術(shù)來檢測“nanoau-cocktail負載的dcs”及“游離ovap/cpg-odns負載的dcs”表面趨化因子受體ccr1、ccr2、cxcr4、ccr5及ccr7的表達率,結(jié)果發(fā)現(xiàn)前者表面ccr7表達顯著高于后者,而ccr1、ccr2及cxcr4分子的表達低于后者。采用腺病毒轉(zhuǎn)染ccr7-shrna的方法下調(diào)dcs表面ccr7的表達,進一步研究ccr7的表達與dcs淋巴組織歸巢的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),ccr7下調(diào)表達后,“nanoau-cocktail負載的dcs”的淋巴結(jié)歸巢能力大大降低,反向證明了nanoau-cocktail所引起的dcs表面ccr7的上調(diào)表達是促使其向淋巴結(jié)歸巢的主要原因。除此之外,本研究同時采用免疫熒光的方法對dcs的細胞骨架進行分析,發(fā)現(xiàn)相較于“游離ovap/cpg-odns負載的dcs”,“nanoau-cocktail負載的dcs”的細胞骨架發(fā)生了更有利于其趨化和遷移的重排。(7)nanoau-cocktail促進dcs疫苗激活在體t細胞研究:為檢測dcs激活t細胞能力,首先采用帶熒光標記四聚體(tetramer)以特異性識別ovap特異性cd8+t細胞;結(jié)果顯示,經(jīng)“nanoau-cocktail負載的dcs”免疫的小鼠,在llns和脾臟(spleen,spl)兩種淋巴器官中均可高比例檢測到抗原特異性cd8+t細胞激活,其比例顯著高于“游離ovap/cpg-odns負載的dcs”免疫組,且llns中cd8+t細胞的激活比例高于spl(5.77±1.94%vs.1.45±0.12%)。隨后,將分離自llns和spl中淋巴細胞與ovap體外共孵育4h后,流式檢測cd8+t細胞中ifn-γ的合成,該結(jié)果與四聚體檢測結(jié)果一致,進一步證明了“nanoau-cocktail負載的dcs”在激活抗原特異性t細胞方面遠優(yōu)于“游離ovap/cpg-odns負載的dcs”。(8)NanoAu-Cocktail促進DCs疫苗抗病毒作用研究:構(gòu)建同時表達螢火蟲熒光素酶(Firefly luciferase,Fluc)、綠色熒光蛋白(GFP)和OVAp的5型嗜肝腺病毒載體(AdFLGO)以模擬肝臟病毒感染。小鼠接受DCs免疫5天后,以109 pfu/鼠經(jīng)尾靜脈接種ADFLGO,采用BLI和免疫熒光兩種方法檢測病毒清除情況。結(jié)果顯示,在“NanoAu-Cocktail負載的DCs”免疫小鼠中,病毒在感染3天后基本得到完全清除,而“游離OVAp/CpG-ODNs”組仍可檢測到大量病毒存在,說明“NanoAu-Cocktail負載的DCs”在抗感染療效上優(yōu)于“游離OVAp/CpG-ODNs負載的DCs”。結(jié)論:通過體內(nèi)外實驗分析發(fā)現(xiàn),由AuNP60/OVAp和AuNP80/Cp G-ODNs組成的NanoAu-Cocktail可使DCs疫苗的抗原遞呈能力提升4-5倍,其總淋巴組織歸巢數(shù)量和LLNs歸巢數(shù)量分別提高15倍和36倍。進一步研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)NanoAu-Cocktail負載的DCs可在SPL和LLNs中有效激活抗原特異性CD8+T細胞反應(yīng),相較于“游離CpG-ODNs/OVAp”負載DCs分別高6.5倍和3.4倍。最后,基于NanoAu-Cocktail的過繼性DCs疫苗可有效保護小鼠免于肝臟病毒的感染,且該疫苗效果優(yōu)于經(jīng)典的Cytokine-Cocktail負載的DCs疫苗和和傳統(tǒng)的可直接用于皮下免疫的蛋白疫苗。本研究從AuNPs形貌和粒徑的選擇出發(fā),并對AuNPs的修飾模式和劑量配比的優(yōu)化篩選,最終揭示了納米佐劑負載的DCs在體遷移、歸巢、分布模式及其機制,以期為新型DCs疫苗的開發(fā)和臨床轉(zhuǎn)化提供參考。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392;TB383.1

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本文編號：2018564