本文選題：巨核細(xì)胞 + 多倍體化��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：背景血小板是人體血液中重要的有形成分之一,其在止血、傷口愈合及炎癥反應(yīng)等生理和病理過程中起著至關(guān)重要的作用。同時(shí)臨床的許多相關(guān)疾病都可導(dǎo)致血小板的減少,其中血液系統(tǒng)疾病、癌癥放療及大劑量化療、嚴(yán)重感染、終末期肝腎疾病等所引起的血小板減少,自身難以恢復(fù),嚴(yán)重危害患者的生命健康,這時(shí)必須反復(fù)預(yù)防和治療性輸注血小板。然而目前的血液成分供應(yīng)卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到臨床所需。大量的研究表明體外利用干細(xì)胞制備血小板是一種可行的方式,這將為血小板的臨床應(yīng)用獲得更多的來源。在血小板的形成過程中,有許多因素影響血小板的增殖、分化、成熟、釋放等,其中巨核細(xì)胞多倍體化的過程對于最終血小板的釋放量有著重要的意義。研究提示,多種小分子化合物能通過對細(xì)胞骨架的調(diào)控促進(jìn)巨核細(xì)胞多倍體化的形成。因此,我們的研究希望通過優(yōu)化小分子化合物的添加獲得更多多倍體的巨核細(xì)胞,為未來規(guī)�；难“逯苽涮峁┬虏呗院图夹g(shù)支持。實(shí)驗(yàn)方法首先我們建立了白血病細(xì)胞系向巨核細(xì)胞分化的培養(yǎng)體系,使用低濃度的佛波酯(PMA)對其進(jìn)行誘導(dǎo)分化,并使用高濃度的PMA對其進(jìn)行多倍體化的誘導(dǎo);通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)志及其細(xì)胞周期的變化,篩選出可獲得更多多倍體的誘導(dǎo)體系,并用于后續(xù)的研究。接下來我們分別將四種不同的小分子化合物尼克酰胺(NIC)、RHO-ROCK通路抑制劑(RRI)、Src通路抑制劑(SI)、Aurora-B通路抑制劑(ABI)單獨(dú)加入到細(xì)胞系誘導(dǎo)體系及臍帶血單個(gè)核細(xì)胞中,并再一步采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞周期的變化,并對巨核細(xì)胞特異性表面標(biāo)志進(jìn)行檢測,同時(shí)通過CCK-8及其細(xì)胞凋亡檢測進(jìn)一步分析細(xì)胞的增殖及凋亡情況,篩選出有利于細(xì)胞多倍體化,同時(shí)又不影響細(xì)胞凋亡的小分子化合物作為優(yōu)選的靶分子。進(jìn)一步檢測不同組合的小分子對多倍體形成的影響,并篩選優(yōu)化出最佳的小分子組合。最終,使用Q-PCR及其Western Blot技術(shù)對優(yōu)選的小分子組合及促進(jìn)白血病細(xì)胞系和造血祖細(xì)胞來源的巨核細(xì)胞多倍體化的機(jī)制進(jìn)行深入探討。結(jié)果在優(yōu)化細(xì)胞系的培養(yǎng)中,采用PMA(0.625ng/ml)進(jìn)行誘導(dǎo)分化3天,再采用PMA(1Ong/ml)對細(xì)胞系進(jìn)行多倍體化誘導(dǎo)9天所形成的多倍體量達(dá)到15%以上,并與其它兩種方式具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。使用不同的四種小分子化合物后,在細(xì)胞系及臍帶血單個(gè)核細(xì)胞中均顯示SI和ABI兩種小分子可以明顯的促進(jìn)巨核細(xì)胞的多倍體化,并分別達(dá)到了 29%以上,原代細(xì)胞中四倍體提高到14%,然而ABI對于原代細(xì)胞有明顯的促凋亡作用,凋亡比例達(dá)到了 70%,而SI在不影響細(xì)胞凋亡的情況下,促進(jìn)多倍體的形成及特異性標(biāo)志CD61的表達(dá),SI是優(yōu)選的小分子化合物。進(jìn)一步檢測其小分子組合的結(jié)果顯示,RRI+SI組合不僅可以提高細(xì)胞多倍體的形成,同時(shí)兩種小分子的加入促進(jìn)了向巨核系分化的特異性表面標(biāo)志的表達(dá)陽性率可提高54.65%,且不影響其細(xì)胞凋亡,從形態(tài)上也可以明顯地觀察到細(xì)胞多倍體。通過對組合小分子作用機(jī)制的探討,結(jié)果顯示SI和RRI可以降低p53及p21基因的表達(dá),從而明顯地提高cyclin D1、cyclin E和cyclin B1幾種細(xì)胞周期蛋白的表達(dá),最終促進(jìn)了多倍體的形成。結(jié)論體外制備血小板是未來重要的血小板來源,目前的研究表明可以通過小分子化合物的應(yīng)用促進(jìn)多倍體的形成,通過比較之間對多倍體的促進(jìn)作用并尋找更有效的小分子組合。從我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,NIC促進(jìn)多倍體的形成效果并不明顯,同樣的我們也發(fā)現(xiàn)ABI盡管促進(jìn)多倍體化明顯,但是其凋亡作用使多倍體最終形成效率明顯的下降。我們的研究顯示RRI+SI的組合不管是加入到細(xì)胞系的培養(yǎng)體系,還是在原代細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用中均可有效地提高巨核細(xì)胞多倍體的形成。對于四種小分子的作用機(jī)制研究尚未有深入的研究,我們研究發(fā)現(xiàn)RRI及SI兩種小分子可以明顯地調(diào)節(jié)多種細(xì)胞周期蛋白,從而調(diào)節(jié)巨核細(xì)胞多倍體的形成。我們的結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了小分子化合物組合在體外促進(jìn)血小板形成并最終應(yīng)用于臨床的可行性。
[Abstract]:Background platelets are one of the most important forming parts of the human blood, which play a vital role in the physiological and pathological processes of hemostasis, wound healing, and inflammatory reactions. Many related clinical diseases can cause thrombocytopenia, including blood system diseases, cancer radiotherapy and large dose chemotherapy, severe infection, end-stage. Thrombocytopenia caused by liver and kidney diseases, which are difficult to recover and seriously harm the life and health of the patients, must be repeatedly prevented and therapeutic infusion of platelets. However, the current supply of blood components is far from the needs of the clinic. A large number of studies have shown that the use of stem cells to prepare platelets in vitro is a feasible way. In the process of platelet formation, there are many factors affecting the proliferation, differentiation, maturation and release of platelets. The process of polyploidy of megakaryocytes is of great significance to the release of the final platelets. The regulation of the frame promotes the formation of megakaryocyte polyploidy. Therefore, our research hopes to provide more polyploidy megakaryocytes by optimizing the addition of small molecular compounds to provide new strategies and technical support for the preparation of future large-scale platelet preparation. Culture system, using low concentration of PMA to induce differentiation, and use high concentration of PMA to induce polyploidy. Through flow cytometry detection of cell surface markers and cell cycle changes, screening out more polyploid inducers, and for subsequent research. Four different small molecular compounds, Nik amide (NIC), RHO-ROCK pathway inhibitor (RRI), Src pathway inhibitor (SI) and Aurora-B pathway inhibitor (ABI), were added to the cell line induction system and umbilical cord blood mononuclear cells alone, and the cell cycle changes were detected by flow cytometry, and the specific surface of megakaryocyte The markers are detected and the cell proliferation and apoptosis are further analyzed by CCK-8 and cell apoptosis, and small molecular compounds, which are beneficial to cell polyploidy and do not affect apoptosis, are selected as the preferred target molecules. Further detection of the effects of small molecules on the formation of polyploidy is further detected. Finally, Q-PCR and its Western Blot technique were used to explore the mechanism of the preferred small molecular combination and the mechanism of promoting the polyploidy of megakaryocytes derived from leukemic cell lines and hematopoietic progenitor cells. Results in the optimization of cell line culture, PMA (0.625ng/ml) was used to induce differentiation for 3 days, and then PMA was used. (1Ong/ml) the amount of polyploidy formed in the induction of polyploidy of the cell line for 9 days is more than 15%, and has significant statistical difference with the other two methods. After using different four small molecular compounds, all of the two small molecules of SI and ABI in the cell lines and umbilical cord blood mononuclear cells can obviously promote megakaryocyte. Ploidy, and more than 29%, the tetraploid in primary cells increased to 14%. However, ABI had obvious apoptosis inducing effect on primary cells, the proportion of apoptosis reached 70%, while SI promoted the formation of polyploid and the expression of specific marker CD61 without affecting apoptosis, and SI was the preferred small molecule compound. The results of small molecular combinations showed that RRI+SI combination could not only improve the formation of cell polyploidy, but the addition of two small molecules promoted the positive rate of the expression of specific surface markers to the megakaryocytes by 54.65%, without affecting the apoptosis of cells. The results show that SI and RRI can reduce the expression of p53 and p21 genes, thus obviously improve the expression of several cell cyclin in cyclin D1, cyclin E and cyclin B1, and eventually promote the formation of polyploid. Conclusion the preparation of platelets in vitro is an important source of platelet in the future. It is possible to promote the formation of polyploidy through the application of small molecular compounds, by comparing the promotion of polyploidy and finding more effective small molecular combinations. Our experimental results show that the effect of NIC on the formation of polyploidy is not obvious. We also found that although ABI promotes polyploidy obviously, its apoptosis is also found. Our study shows that the combination of RRI+SI can effectively improve the formation of polyploid megakaryocyte in the culture system of cell lines or in the application of primary cell culture. Research on the mechanism of action for four small molecules has not yet been studied in depth. It is found that two small molecules of RRI and SI can regulate a variety of cell cycle proteins to regulate the formation of polyploidy in megakaryocytes. Our results further verify the feasibility of the combination of small molecule compounds to promote platelet formation in vitro and eventually to be used in clinical practice.
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R392

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本文編號：1989817