發(fā)布時間：2018-06-07 02:45

  本文選題：鼠疫耶爾森氏菌 + Ⅲ型分泌系統(tǒng)��； 參考：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2017年博士論文

【摘要】：本論文涉及兩個部分,即《鼠疫耶爾森氏菌III型分泌系統(tǒng)蛋白YscI-YscF相互作用的研究》和《鼠疫耶爾森氏菌蛋白質(zhì)組學(xué)分析及新毒力因子的鑒定。摘要及正文將分為兩個部分撰寫。摘要一 鼠疫耶爾森氏菌III型分泌系統(tǒng)蛋白YscI-YscF相互作用的研究III型分泌系統(tǒng)(Type III Secretion System,T3SS)是一種高度保守的毒力機制,廣泛分布于革蘭氏陰性菌中,能夠?qū)⑿?yīng)蛋白直接分泌到宿主細胞的細胞質(zhì)中。該系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)類似于一支注射器,由兩部分組成,分別是橫跨于細菌內(nèi)膜、周質(zhì)及外膜的多環(huán)基座以及將毒力蛋白輸送到宿主細胞內(nèi)的中空針頭。鼠疫菌的T3SS由pCD1質(zhì)粒編碼而成,是由20余種蛋白質(zhì)構(gòu)成的一種超分子復(fù)合物,含有許多高度保守結(jié)構(gòu),通過耗能將分泌性V抗原(LcrV)和耶爾森氏菌外膜蛋白(Yersinia outer proteins,Yops)由宿主細胞表面形成的小孔結(jié)構(gòu)注入到宿主細胞內(nèi),從而達到干擾細胞發(fā)揮其正常生理功能的目的。鼠疫菌的pCD1質(zhì)粒共編碼90多個基因,除去部分假基因和轉(zhuǎn)座酶相關(guān)基因后,共57個基因編碼T3SS相關(guān)蛋白。在本實驗室的前期工作中,已通過酵母雙雜交陣列篩選技術(shù)篩選到57個蛋白之間的21個相互作用對,其中新發(fā)現(xiàn)12對,包括YscF-YscI。YscF的多聚體在細菌表面形成注射小體的針狀結(jié)構(gòu),YscI是連接T3SS裝置分泌通道內(nèi)外環(huán)的蛋白。前期實驗中已采用GST-pull down驗證了YscI-YscF體外存在相互作用,并通過構(gòu)建Ysc I截短突變體的方法確定介導(dǎo)二者體外相互作用的結(jié)構(gòu)域位于YscI的第83-92位氨基酸。本研究中,將通過免疫共沉淀等方法繼續(xù)驗證YscF-YscI的體內(nèi)相互作用關(guān)系,并探討其相互作用的生理功能。首先,本研究利用λ-Red重組系統(tǒng)構(gòu)建鼠疫菌yscI基因突變株。再以阿拉伯糖誘導(dǎo)的pBAD24質(zhì)粒為載體構(gòu)建帶FLAG標(biāo)簽的yscI互補株及yscI截短突變體,并將成功構(gòu)建的新載體導(dǎo)入yscI突變株,分別為△yscI-FLAG-YscI、△yscI-C△73-85、△yscI-C△83-92、△yscI-C△93-102和△yscI-C△93-102。接下來,運用免疫共沉淀(Co-IP)的方法在FLAG樹脂結(jié)合下來的樣品中檢測到了YscF蛋白,驗證了YscI-YscF在體內(nèi)存在相互作用;并使用同樣的實驗方法對不同突變菌株進行檢測,結(jié)果,對△yscI-C△83-92、△yscI-C△93-102菌株的Co-IP實驗中,FLAG樹脂結(jié)合下來的樣品中未檢測到Y(jié)scF蛋白。以上結(jié)果說明,影響YscI-Ysc F體內(nèi)相互作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域位于YscI蛋白C末端的第83-102位氨基酸。本研究分別運用YscF聚合體交聯(lián)的方法檢測上述構(gòu)建的yscI互補株以及yscI截短突變株在細菌表面組裝YscF針狀結(jié)構(gòu)的能力;運用WB免疫印跡的方法檢測其表達及分泌YscI、YscF以及效應(yīng)蛋白YopN、YopM、Yop E、YopK和LcrV的能力。結(jié)果表明:鼠疫菌yscI互補株和yscI截短突變株均可以在菌體內(nèi)表達Ysc I和YscF,但不能分泌到上清中;在△yscI、△yscF和△yscI-C△83-92的菌體表面未檢測到Y(jié)scF多聚體,在其分泌上清中也未檢測到效應(yīng)蛋白;在△yscI-C△93-102細菌表面能檢測到Y(jié)scF多聚體,但該菌株不能夠正常分泌效應(yīng)蛋白。以上結(jié)果闡明,當(dāng)YscI的第83-92位氨基酸缺失時,該突變株不能形成針狀結(jié)構(gòu)且無法分泌效應(yīng)蛋白;當(dāng)?shù)?3-102位氨基酸缺失時,該菌株組裝YscF針狀結(jié)構(gòu)的能力受到一定影響,但其分泌效應(yīng)蛋白的功能并未完全喪失。針對YscI的83-92位氨基酸區(qū)域進行序列比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ysc I的第85、86、88和92位氨基酸與YscF同源性高。因此,本研究構(gòu)建了C末端帶有FLAG標(biāo)簽的yscI點突變體,并導(dǎo)入yscI突變株,分別為△yscI-CW85A、△yscI-CS86A、△yscI-CI88A以及△ysc I-CI92A。利用免疫共沉淀方法檢測與YscF體內(nèi)相互作用,結(jié)果在對△yscI-CW85A、△yscI-CS86A菌株的Co-IP實驗中,FLAG樹脂結(jié)合下來的樣品中未檢測到Y(jié)scF蛋白。利用GST-pull down方法檢測與YscF體外相互作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)YscI-W85A或YscI-S86A與YscF未發(fā)生結(jié)合。以上結(jié)果表明,YscI第85或86位氨基酸的缺失,同時影響了YscI與YscF之間體內(nèi)外的相互作用。本研究進一步發(fā)現(xiàn)無法在△yscI-CW85A和△yscI-CS86A的細菌表面檢測到Y(jié)scF多聚體,也無法在其上清中檢測到效應(yīng)蛋白。這一結(jié)果闡明,YscI的第85或86位氨基酸缺失導(dǎo)致YscI-YscF失去相互作用,并且該突變株也不能形成針狀結(jié)構(gòu)和分泌效應(yīng)蛋白。本研究還通過觀察細菌感染Hela細胞后形態(tài)的變化,以及用無標(biāo)記細胞實時定量分析法研究鼠疫菌yscI截短及點突變株的細胞毒性。在顯微鏡下,我們看到野生株鼠疫菌感染3h后的Hela細胞明顯變圓,表明效應(yīng)蛋白破壞細胞骨架;而△yscI、△yscF、△yscI-C△83-92、△yscI-C△93-102、△yscI-CW85A以及△yscI-CS86A感染的Hela細胞形態(tài)更接近于正常細胞,這說明以上菌株對Hela細胞的毒力作用已大幅度減弱。本研究還利用免疫印跡的方法檢測了yscI截短及點突變株感染Hela細胞后向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運效應(yīng)蛋白的能力,結(jié)果表明對HeLa細胞毒力明顯減弱的幾株突變株同樣不能將效應(yīng)蛋白Lcr V、Yop M和Yop E轉(zhuǎn)運到細胞胞漿中。摘要二 鼠疫耶爾森氏菌蛋白質(zhì)組學(xué)分析及新毒力因子的鑒定鼠疫(plague)是由鼠疫耶爾森氏菌引起的烈性傳染病,主要由節(jié)肢動物跳蚤通過叮咬傳染給宿主嚙齒類動物,并有可能傳播給人導(dǎo)致腺鼠疫、肺炎鼠疫和敗血癥等的發(fā)生,給人們造成了巨大的生命和財產(chǎn)損失。本研究利用蛋白質(zhì)組技術(shù),在鼠疫菌全基因組測序已完成的基礎(chǔ)上,對鼠疫菌201株在兩種不同的生理條件下,即26°C含鈣(模擬跳蚤體內(nèi)環(huán)境)和37°C低鈣(模擬哺乳動物體內(nèi)環(huán)境)的蛋白質(zhì)組展開研究,并進一步發(fā)現(xiàn)鼠疫菌致病的新的關(guān)鍵毒力因子,為防治鼠疫菌和新疫苗研究提供更多方法和靶標(biāo)。首先,本研究制備出鼠疫菌在26°C含鈣和37°C低鈣培養(yǎng)條件下的分泌蛋白質(zhì)組和菌體蛋白質(zhì)組。該過程主要使用TMH人工合成培養(yǎng)基培養(yǎng)鼠疫菌,在兩種條件下培養(yǎng)8h,然后使用超濾法進行上清蛋白的濃縮,菌體用含尿素裂解液裂解,并用BCA試劑盒測量菌體蛋白和上清蛋白的濃度。此外,為了實現(xiàn)對鼠疫菌T3SS不同蛋白質(zhì)組分的動態(tài)監(jiān)控,在8h分泌時間內(nèi)選擇了一系列時間點作為分泌時間,分別為,80min、160min、240min、320min、400min和480min,制備出不同時間序列的分泌蛋白質(zhì)組及菌體蛋白質(zhì)組樣品。在本研究中,我們通過同量異序化學(xué)標(biāo)簽(Tandem Mass Tags,TMT)法對樣品進行定量分析。TMT是通過串聯(lián)質(zhì)譜同時定量鑒定不同樣品中蛋白質(zhì)的有效工具。這些小化學(xué)分子標(biāo)簽的結(jié)構(gòu)類似,以共價結(jié)合賴氨酸的氨基末端的方式標(biāo)記蛋白樣品中的多肽。在質(zhì)譜分析中,每種分子量的TMT標(biāo)簽都能生成一個特殊的離子圖譜,通過比較不同標(biāo)簽標(biāo)記的離子的相對豐度實現(xiàn)了對蛋白的相對定量。我們共檢測到2141個鼠疫菌蛋白質(zhì),占基因組預(yù)測CDS的52.2%。其中1081個蛋白質(zhì)同時出現(xiàn)在分泌和菌體蛋白質(zhì)組中。將Score≥5和Unique Peptide≥2作為定義潛在分泌蛋白的標(biāo)準,共在培養(yǎng)上清中檢測到767個分泌蛋白,其中Yp-2058、Yp-3657和Yp_3415-Yp_3418幾種未知功能的蛋白在37°C表達上調(diào),可能與鼠疫菌在宿主動物中的毒力密切相關(guān)。在研究T3SS的分泌蛋白動態(tài)變化實驗中,根據(jù)不同時間序列的蛋白質(zhì)組樣品的質(zhì)譜結(jié)果分析,未觀察到鼠疫菌T3SS蛋白組分隨時間的蛋白特異性變化規(guī)律,推測可能是由于最短分泌時間80min時,分泌蛋白質(zhì)種類已基本趨于穩(wěn)定。本研究建立了一種新方法分辨哪些蛋白是T3SS的分泌蛋白,即將上清/菌體的PSM值大于1作為分泌蛋白的評判標(biāo)準。發(fā)現(xiàn)根據(jù)上清/菌體的PSM值大于1為標(biāo)準判斷鑒定出的T3SS分泌底物的蛋白,均是文獻中已經(jīng)報道的分泌蛋白;而那些比值小于1的蛋白為T3SS結(jié)構(gòu)蛋白、ATP酶以及轉(zhuǎn)運蛋白等。在分子實驗部分中,針對篩選出的高表達分泌蛋白質(zhì)Yp_3416、Yp_3417、Yp_3418、Yp_2058和Yp_3657進行毒力及功能的驗證。本研究采用基于p DS132自殺載體的方法構(gòu)建yp_3416、yp_3418和yp_3416-3418的無痕突變株。分別以尾靜脈感染途徑和滴鼻感染途徑對小鼠進行攻毒實驗,繪制出生存曲線。結(jié)果表明,經(jīng)尾靜脈感染后,鼠疫菌野生株與yp_3416突變株,yp_3416-3418突變株的生存曲線差異有統(tǒng)計學(xué)意義,與yp_3418突變株無差異;滴鼻感染結(jié)果中,野生株與以上3株突變株的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。本研究還構(gòu)建出yp_3416、yp_3417、yp_3418、yp_2058和yp_3657的β-內(nèi)酰胺酶(TEM)報告質(zhì)粒,導(dǎo)入鼠疫菌野生株后,分別感染Hela細胞。當(dāng)靶蛋白進入宿主細胞時,與靶蛋白融合表達的β-內(nèi)酰胺酶可降解細胞內(nèi)CCF2-AM染料分子,在409nm光的照射下發(fā)出447nm的藍光;而靶蛋白未進入細胞時,完整的CCF2-AM具有熒光能量共振轉(zhuǎn)移現(xiàn)象,在409nm光的照射下發(fā)出520nm的綠光。利用該原理,研究Yp_3416、Yp_3417、Yp_3418、Yp_2058和Yp_3657五種靶蛋白能否被轉(zhuǎn)運到真核細胞內(nèi)。結(jié)果表明,以上五種蛋白均能轉(zhuǎn)運到真核細胞內(nèi),且轉(zhuǎn)運效率較高。這一結(jié)果為新鑒定分泌蛋白質(zhì)因子功能的后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:This paper deals with the interaction between YscI - YscF and YscI - YscF . The results showed that YscI - CW85A , 鈻，

本文編號：1989388