本文選題：miR-223 + 靶基因��； 參考：《華中科技大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：第一部分miR-223調(diào)控子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞IGF-1R的表達(dá) 目的：構(gòu)建miR-223過(guò)表達(dá)慢病毒載體,通過(guò)轉(zhuǎn)染RL95-2上皮細(xì)胞系明確miR-223在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中的靶基因。 方法：利用TargetScan5.1獲得miR-223的潛在靶基因信息；采用慢病毒轉(zhuǎn)染體系上調(diào)RL95-2上皮細(xì)胞系中miR-223的表達(dá),分別用real-time PCR、Western Blot檢測(cè)預(yù)測(cè)靶基因mRNA和蛋白表達(dá)水平；構(gòu)建miR-223的靶標(biāo)克隆載體,利用雙熒光素酶報(bào)告基因載體確定靶基因。 結(jié)果：(1)根據(jù)TargetScan5.1預(yù)測(cè)得到miR-223的潛在靶基因IGF-1R、FOXO1、E2F1、 IKKα;(2)過(guò)表達(dá)RL95-2上皮細(xì)胞中miR-223后IGF-1R、FOXO1、E2F1、IKKα的mRNA表達(dá)均無(wú)改變,但是IGF-1R的蛋白表達(dá)明顯下降；(3)雙熒光素酶報(bào)告基因證實(shí)miR-223直接調(diào)節(jié)IGF-1R的表達(dá)。 結(jié)論：miR-223作用在IGF-1R的3’UTR調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞IGF-1R的蛋白表達(dá)。 第二部分miR-223和IGF-1R在人類(lèi)子宮內(nèi)膜的表達(dá)規(guī)律 目的：通過(guò)檢測(cè)月經(jīng)周期不同時(shí)期子宮內(nèi)膜miR-223和IGF-1R的表達(dá),觀察人類(lèi)子宮內(nèi)膜上miR-223和IGF-1R的表達(dá)趨勢(shì)。 方法：利用Real-time PCR檢測(cè)增生中期和分泌中期子宮內(nèi)膜miR-223和IGF-1R mRNA的表達(dá)水平,Western Blot和免疫組化檢測(cè)增生中期和分泌中期子宮內(nèi)膜IGF-1R的蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞定位。 結(jié)果：(1)Real-time PCR結(jié)果顯示miR-223在分泌中期子宮內(nèi)膜的表達(dá)明顯低于增生中期子宮內(nèi)膜,而IGF-1R的mRNA在兩組子宮內(nèi)膜上的表達(dá)未見(jiàn)明顯改變；(2)Western Blot結(jié)果顯示IGF-1R蛋白在分泌中期子宮內(nèi)膜上的表達(dá)明顯高于增生中期子宮內(nèi)膜；(3)免疫組化結(jié)果顯示IGF-1R主要表達(dá)在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞上,且分泌中期子宮內(nèi)膜上的表達(dá)明顯高于增生中期子宮內(nèi)膜。 結(jié)論：miR-223和IGF-1R在人類(lèi)子宮內(nèi)膜上的表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān),進(jìn)一步證實(shí)了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)論。 第三部分過(guò)表達(dá)miR-223抑制胚胎的植入 目的：通過(guò)體外滋養(yǎng)細(xì)胞球侵入模型和在體胚胎植入模型研究miR-223對(duì)胚胎植入的影響。 方法：利用Bewo滋養(yǎng)細(xì)胞和RL95-2上皮細(xì)胞系構(gòu)建內(nèi)膜-滋養(yǎng)細(xì)胞球相互作用的體外侵入模型,觀察Bewo細(xì)胞球在單層內(nèi)膜上皮細(xì)胞上的侵入情況；建立小鼠妊娠模型,使用miR-223激動(dòng)劑干預(yù)小鼠子宮內(nèi)膜miR-223的表達(dá),觀察miR-223對(duì)胚胎植入的影響。 結(jié)果：(1)在Bewo細(xì)胞球和RL95-2上皮細(xì)胞共培養(yǎng)體系中,過(guò)表達(dá)miR-223組Bewo細(xì)胞球的侵入率明顯低于對(duì)照組,添加IGF-1可逆轉(zhuǎn)miR-223對(duì)Bewo細(xì)胞球的抑制效果；(2)小鼠宮角注射miR-223激動(dòng)劑干預(yù)后小鼠著床胚胎數(shù)明顯下降。 結(jié)論：體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證實(shí)了miR-223抑制胚胎著床,且這一抑制效應(yīng)可能是通過(guò)調(diào)節(jié)IGF-1R實(shí)現(xiàn)的。
[Abstract]:Part one: miR-223 regulates the expression of IGF-1R in endometrial epithelial cells Aim: to construct miR-223 overexpression lentivirus vector and to identify the target gene of miR-223 in endometrial epithelial cells by transfection of RL95-2 epithelial cell line. Methods: the potential target gene information of miR-223 was obtained by TargetScan5.1, the expression of miR-223 in RL95-2 epithelial cell line was up-regulated by lentivirus transfection system, the expression level of mRNA and protein was predicted by real-time PCR Western Blot, and the target clone vector of miR-223 was constructed. The target gene was identified by double luciferase reporter gene vector. Results according to TargetScan5.1 prediction, the miR-223 potential target gene IGF-1RnFOXO1E2F1 (IKK 偽 F2F1) overexpression in RL95-2 epithelial cells showed no change in mRNA expression after miR-223, but the expression of IGF-1R protein decreased significantly (3) the double luciferase reporter gene confirmed that miR-223 directly regulated the expression of IGF-1R. Conclusion the 3'UTR of IGF-1R regulates the expression of IGF-1R protein in endometrial epithelial cells. The second part: the expression of miR-223 and IGF-1R in human endometrium Aim: to observe the expression trend of miR-223 and IGF-1R in human endometrium by detecting the expression of miR-223 and IGF-1R in endometrium at different periods of menstrual cycle. Methods: Real-time PCR was used to detect the expression of miR-223 and IGF-1R mRNA in the endometrium of metaphase hyperplasia and middle secretory period. Western Blot and immunohistochemistry were used to detect the expression and localization of IGF-1R in the middle and middle secretory phase of endometrium. Results the results of Real-time PCR showed that the expression of miR-223 in the middle secretory endometrium was significantly lower than that in the proliferative endometrium. The expression of IGF-1R mRNA in the endometrium of the two groups did not change significantly. The results of Western Blot showed that the expression of IGF-1R protein in the middle secretory endometrium was significantly higher than that in the proliferative endometrium. On the endometrial epithelial cells, And the expression of endometrial secretory medium was significantly higher than that of proliferative endometrium. Conclusion there is a negative correlation between the expression of miR-223 and IGF-1R in human endometrium, which further confirms the conclusion of cell experiment. The third part: overexpression of miR-223 inhibits embryo implantation Aim: to study the effect of miR-223 on embryo implantation by invading trophoblast ball in vitro and in vivo embryo implantation model. Methods: Bewo trophoblastic and RL95-2 epithelial cell lines were used to establish an in vitro invasion model of intima-trophoblastic interaction, to observe the invasion of Bewo cells on monolayer endometrial epithelial cells, and to establish a mouse pregnancy model. MiR-223 agonist was used to interfere the expression of miR-223 in mouse endometrium and to observe the effect of miR-223 on embryo implantation. Results in the co-culture system of Bewo cell ball and RL95-2 epithelial cell, the invasion rate of Bewo cell ball in over-expressed miR-223 group was significantly lower than that in control group. The inhibitory effect of miR-223 on Bewo cells was reversed by adding IGF-1. The number of implanted embryos in mice was significantly decreased after the injection of miR-223 agonist into uterine horn of mice. Conclusion: the results of in vivo and in vitro experiments confirm that miR-223 inhibits embryo implantation, and this inhibitory effect may be achieved by regulating IGF-1R.
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R321

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本文編號(hào)：1982069