本文選題：CRISPR + PECAM-1�。� 參考：《華中科技大學》2016年博士論文

【摘要】：目的：PEC AM-1是一個分子量為130k的蛋白,屬于免疫球蛋白超家族的成員之一,主要在造血細胞系上以及單層內(nèi)皮細胞—細胞間隙處表達。有研究表明,PEC AM-1的胞內(nèi)段在內(nèi)皮細胞中有多重調(diào)控功能。PEC AM-1的胞內(nèi)段是內(nèi)皮細胞機械應答反應的必要條件,還對凋亡刺激起到細胞保護作用,并與細胞連接處其他的粘附蛋白和細胞骨架分子相互作用。而以上功能不依賴于位于胞內(nèi)段的免疫受體抑制性基序。鑒于胞內(nèi)段的堿基長度,可以推測其他堿基可能在上述過程中起到作用。所以本課題的研究目的是探究PEC AM-1的胞內(nèi)段是否參與內(nèi)皮細胞-細胞邊界定位和內(nèi)皮屏障功能的維持,以維持血管的完整性。方法：用CRISPR基因編輯技術(shù)建立PEC AM-1敲除的永生化人臍靜脈內(nèi)皮細胞系,稱為PE-KO;通過兩條sgRNA以在原位切除PEC AM-1胞內(nèi)段的基因,以得到表達ΔCD-PECAM-1的細胞,稱為ΔCD-iHUVECs。因為內(nèi)皮細胞有轉(zhuǎn)染效率低的特點,我們用含有兩條sgRNA和Cas9核酸酶cDNA的慢病毒感染iHUVECs。在用嘌呤霉素選擇性培養(yǎng)慢病毒感染的細胞后,iHUVECs被流式細胞儀分選為單個克隆。隨后分別用PECAM-1胞外段和胞內(nèi)段特異性的抗體,通過流式細胞術(shù)分析鑒定所得克隆細胞。為測定ΔCD-PECAM-1的功能,用共聚焦免疫熒光觀察其在內(nèi)皮細胞中的邊界定位,用電細胞—基質(zhì)阻抗傳感儀評估屏障功能,用流式細胞術(shù)測定PECAM-1/IgG結(jié)合能力以確定同嗜性結(jié)合能力。結(jié)果：我們成功建立并鑒定了兩個獨特的iHUVECs細胞系：一個徹底敲除了PEC AM-1表達,另一個細胞系表達ΔCD-PECAM-1。共聚焦顯微鏡顯示ΔCD-PECAM-1可定位于融合內(nèi)皮細胞的邊界。與表達WT PECAM-1的細胞相比,表達ΔCD-PECAM-1的iHUVECs有更高的靜息阻抗,而PECAM-1敲除的iHUVECs的靜息阻抗則顯著下降。用凝血酶破壞內(nèi)皮細胞屏障功能后,表達ΔCD-PECAM-1的細胞則能更快的恢復屏障,而PE-KO的恢復速率卻顯著低于表達WT-iHUVECs。最后,與表達WT PECAM-1的細胞相比,在iHUVECs上表達的ΔCD-PECAM-1與PECAM-1/IgG的親和性則明顯下降。結(jié)論：PECAM-1這一細胞粘附信號受體,在內(nèi)皮細胞—細胞邊界處聚集的能力,并不依賴于其胞內(nèi)段的表達。而ΔCD-PECAM-1與其它PECAM-1分子有較低的同嗜性結(jié)合親和力,這導致表達ΔCD-PECAM-1的內(nèi)皮細胞有更高的靜息屏障功能,以及在凝血酶刺激后,能更快的重建內(nèi)皮細胞邊界的完整性。綜上所述,以上結(jié)果表明PECAM-1胞內(nèi)段可能與內(nèi)皮細胞骨架蛋白相互作用,從而限制了它在內(nèi)皮細胞膜平面的移動性。而缺乏胞內(nèi)段的PECAM-1得到釋放,有更大的移動性,從而能更好的維持內(nèi)皮細胞—細胞間隙的完整性。
[Abstract]:Objective: AM-1 is a 130k protein, which belongs to the immunoglobulin superfamily. It is expressed mainly in hematopoietic cell lines and the endothelial cell-cell intercellular space of monolayer. Studies have shown that the intracellular segment of PEC AM-1 has multiple regulatory functions in endothelial cells. The intracellular segment of PEC AM-1 is a necessary condition for the mechanical response of endothelial cells, and also plays a cytoprotective role in apoptosis stimulation. It also interacts with other adhesion proteins and cytoskeleton molecules at cell junctions. These functions are independent of the immunoreceptor inhibitory motifs located in the intracellular domain. Given the length of the base in the intracellular segment, it can be speculated that other bases may play a role in the above process. Therefore, the purpose of this study is to explore whether the intracellular segment of PEC AM-1 is involved in endothelial cell-cell boundary localization and endothelial barrier function maintenance, in order to maintain the integrity of blood vessels. Methods: the immortalized human umbilical vein endothelial cell line (PE-KOO) with PEC AM-1 knockout was established by CRISPR gene editing technique, and 螖 CD-iHUVECs was obtained by in situ excision of PEC AM-1 intracellular segment by two sgRNA. Because of the low transfection efficiency of endothelial cells, lentivirus containing two sgRNA and Cas9 nuclease cDNA was used to infect iHUVECs. After selective culture of lentivirus infected cells with purine mycin, iHUVECs were separated into a single clone by flow cytometry. The cloned cells were identified by flow cytometry with specific antibodies of extracellular and intracellular segments of PECAM-1. In order to determine the function of 螖 CD-PECAM-1, the boundary localization of 螖 CD-PECAM-1 in endothelial cells was observed by confocal immunofluorescence. The barrier function was evaluated by electrocell-matrix impedance sensor and the binding ability of PECAM-1/IgG was determined by flow cytometry. Results: we successfully established and identified two unique iHUVECs cell lines: one completely knocked out the expression of PEC AM-1 and the other expressed 螖 CD-PECAM-1. Confocal microscopy showed that 螖 CD-PECAM-1 could locate the boundary of fused endothelial cells. Compared with the cells expressing WT PECAM-1, the iHUVECs expressing 螖 CD-PECAM-1 has a higher resting impedance, while the PECAM-1 knockout iHUVECs has a significantly lower resting impedance. After thrombin was used to destroy endothelial cell barrier function, the cells expressing 螖 CD-PECAM-1 could recover the barrier more quickly, while the recovery rate of PE-KO was significantly lower than that of WT-iHUVECs. Finally, compared with the cells expressing WT PECAM-1, the affinity of 螖 CD-PECAM-1 expressed on iHUVECs to PECAM-1/IgG decreased significantly. Conclusion the ability of the cell adhesion signal receptor: 1 PECAM-1 to gather at the endothelial cell-cell boundary does not depend on the expression of its intracellular segment. However, 螖 CD-PECAM-1 has lower affinity to other PECAM-1 molecules, which leads to higher resting barrier function of endothelial cells expressing 螖 CD-PECAM-1, and faster reconstruction of endothelial cell boundary integrity after thrombin stimulation. In conclusion, the above results suggest that the intracellular segment of PECAM-1 may interact with the endothelial cytoskeleton protein, thus limiting its mobility in the endothelial cell membrane plane. However, PECAM-1, which lacks the intracellular segment, is released and has greater mobility, thus maintaining the integrity of the endothelial cell-cell space.
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R392

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本文編號：1962369