發(fā)布時間：2018-06-01 03:12

  本文選題：Hedgehog + Sufu　； 參考：《南京醫(yī)科大學》2015年博士論文

【摘要】：Hh蛋白家族調控著一系列發(fā)育的過程和腫瘤的產生,Hh通路的失調在發(fā)育紊亂和癌癥中均有作用。例如,對于指導從四肢到中樞神經系統(tǒng)發(fā)育、基底細胞癌和髓母細胞瘤的產生,具有深遠的影響。美國藥監(jiān)局批準的對抗BCC轉移的Hh通路抑制劑表明了Hh在癌癥治療中的重要性;而且對于其它癌癥的研究,許多臨床試驗仍在開展當中。Hh是一個形態(tài)發(fā)生因子,它沿著發(fā)育軸線形成濃度梯度而發(fā)揮作用。在神經管發(fā)育過程中,它從脊索和底板中表達,并且一直延伸到背部。Hh蛋白是Ptch的配基。Ptch是一種12次跨膜蛋白,它能反向調節(jié)7次跨膜蛋白Smo。Hh配基與Ptch結合,導致Smo的激活。這將導致Smo轉運至原纖毛中,Hh通路也得以正常轉運。Smo的下游是Gli家族,它們是一組鋅指轉錄因子。在哺乳動物中具有三個同源蛋白,Gli1、Gli2和Gli3。Sufu作為Gli蛋白的分子伴侶,能夠與所有的Gli蛋白結合而形成復合物。Sufu能夠與Gli氨基端高度保守的SYGH結構域結合,又或者通過遮擋Gli的核輸入信號(NLS),從而將Gli阻滯在細胞漿中,使得Gli蛋白被Sufu抑制。然而現(xiàn)在并不清楚Sufu對于調節(jié)Gli胞漿阻滯的具體機制。隨著Hh的刺激,Gli蛋白轉運至細胞核中,暗示Sufu對于Gli在胞漿中的錨定功能被解除了。然而,生物化學和遺傳學研究表明Sufu調節(jié)Gli的活性是通過其它非胞漿阻滯機制。這就暗示Sufu與Gli蛋白在細胞核中仍然能夠結合。然而,Sufu調控Gli蛋白的詳細機制還不明確。由于Hh在小腦發(fā)育中起到十分重要的作用,我們利用小腦為模型進行研究。在成年小鼠小腦中,Hh通路是處于靜息狀態(tài),但是在出生一周多之后,小腦發(fā)育處于高強度,Sufu的水平與Gli一樣,在外胚層顆粒神經元前體中表達都很高。這部分細胞的發(fā)育高度依賴hh信號的輸出。在髓母細胞瘤這一來自于顆粒神經元前體的小腦腫瘤中,hh通路被重新激活,與之前一樣的是,sufu的水平同gli1一致高度上調。除此之外,sufu在細胞核和細胞漿中均有定位。為了進一步觀察sufu在細胞核和細胞漿中的分布,我們檢測了小鼠胚胎成纖維細胞系(mefs)。在正常的mefs中,無論shh處理與否,sufu在胞核和胞漿中均有分布。當我們檢測gli2/3缺失的細胞時,令我們驚訝的是sufu在沒有shh時幾乎處于細胞漿中。而當有shh時,sufu被誘導至細胞核中,在gli2/3缺失的細胞中是不存在抑制子的。這就暗示在正常mefs中,在沒有shh處理的情況下,sufu很有可能是被抑制子帶入到細胞核的。在gli2/3缺失的細胞中,shh誘導sufu入核是由gli1介導的。為了證明這一點,我們在gli2/3缺失的細胞中穩(wěn)定表達gli1的shrna,從而構建三種gli都沒有的細胞系。在這種細胞系中,sufu的入核不再受到shh的誘導。sufu能夠招募sin3a和hdac從而抑制gli的轉錄活性。我們重新考慮了這個模式并且探究sufu能否出現(xiàn)在gli結合位點的染色質上。我們以gli1和ptch1的啟動子為例,利用chip實驗,兩個位點在shh處理之后,gli結合元件的含量增加,暗示shh能夠誘導sufu招募至其靶基因啟動子區(qū)域。有趣的是,我們同樣發(fā)現(xiàn)sap18在hh的靶基因啟動子上,hh能夠促使其從染色質上脫落。這些結果暗示hh能夠誘導gli1-sufu復合物附著在它的靶基因啟動子區(qū)域,而且這是依賴于gli1和gli3抑制子。為了找到決定sufu在胞漿和胞核中分布的序列原件,我們做了缺失定位,最后確定在人類sufu的308-318殘基中具有潛在的nes信號。我們將其中兩個亮氨酸突變成丙氨酸并且在mefs中進行檢測。相比于野生型的sufu,nes突變的sufu更多的出現(xiàn)在細胞核中。而且nes的受體crm1也不再與突變的sufu結合。本實驗室之前報道了一個pka和gsk3β雙磷酸化位點能夠調節(jié)sufu的穩(wěn)定性和原纖毛轉運。這個雙磷酸化位點正好處于nes的附近。在coip實驗中,我們發(fā)現(xiàn)在342或者346位點不能被磷酸化而突變的sufu與crm1具有有效的結合能力,而模擬磷酸化的sufu則失去了與crm1結合的能力。最后,我們將正常Sufu-GFP與GSK-3β、PKA單獨或者二者聯(lián)合共轉染,發(fā)現(xiàn)更多的Sufu在細胞核中,但是這些激酶對非磷酸化的Sufu,即雙A突變并不能起到作用。上述結果闡明了Sufu不僅能夠參與Gli介導的轉錄、抑制信號通路,同時還能通過提高Gli1蛋白的細胞核轉運和穩(wěn)定性,從而提高Hh通路活性,這對于Shh通路的最大化激活是必須的。使我們對于Sufu作為Gli蛋白分子伴侶有了新的認識。
[Abstract]:The Hh protein family regulates a series of developmental processes and tumours, and the maladjustment of the Hh pathway plays a role in development disorders and cancers. For example, it has a far-reaching impact on the development of the limb to central nervous system, basal cell carcinoma and medulloblastoma. The Hh pathway approved by the United States Drug Administration to combat BCC metastasis The preparation shows the importance of Hh in cancer treatment; and for other cancers, many clinical trials are still developing in which.Hh is a morphogenetic factor that forms a concentration gradient along the development axis. In the process of neural tube development, it is expressed from the chord and the floor and extends to the back.Hh protein. The Ptch ligand.Ptch is a 12 transmembrane protein, which can reverse the 7 transmembrane protein Smo.Hh ligand binding with Ptch and lead to Smo activation. This will lead to the transport of Smo into the primary cilia, and the Hh pathway is also the downstream of the normal transport of.Smo, which is a group of zinc finger transcription factors. In mammals, there are three homologous proteins, Gli, Gli. 1, Gli2 and Gli3.Sufu, as a molecular chaperone of Gli protein, can bind to all Gli proteins and form complex.Sufu to bind to the highly conserved SYGH domain of the Gli amino terminal, or by blocking the nuclear input signal (NLS) of Gli, so that Gli is blocked in the cytoplasm, making Gli protein suppressed by Sufu. U is a specific mechanism for regulating Gli cytoplasmic block. With the stimulation of Hh, Gli protein is transported to the nucleus, suggesting that Sufu has been relieved of the anchoring function of Gli in the cytoplasm. However, biochemical and genetic studies have shown that the activity of Sufu to regulate Gli is through other non cytoplasmic blocking mechanisms. This implies that Sufu and Gli proteins are in the nucleus. However, the detailed mechanism of the Sufu regulation of Gli protein is still unclear. Since Hh plays a very important role in the development of the cerebellum, we use the cerebellum as a model to study. In the cerebellum of adult mice, the Hh pathway is resting state, but after more than one week of birth, the cerebellum is in high intensity, the level of Sufu and Gl The expression of I is high in the precursor of the ectodermal granular neurons. The development of this part of the cells depends on the output of the Hh signal. The Hh pathway is reactivated in the medulloblastoma, a cerebellar tumor, which comes from the precursor of granular neurons. As before, the level of Sufu is up to the same level as Gli1. In addition, Sufu is in the cell. In order to further observe the distribution of Sufu in the nucleus and cytoplasm, we detected the mouse embryonic fibroblast line (MEFs). In normal MEFs, no matter Shh treatment or not, Sufu is distributed in the nucleus and cytoplasm. When we detect the cells missing from gli2/ 3, we are surprised that Sufu is not. Shh is almost in the cytoplasm. And when there is Shh, Sufu is induced into the nucleus, and there is no suppressor in the gli2/3 missing cells. This suggests that in normal MEFs, in the absence of Shh treatment, Sufu is likely to be brought into the nucleus by the suppressor. In gli2/3 missing cells, shh induced Sufu entry is Gli1. Mediated. In order to prove this, we stably express Gli1 shRNA in gli2/3 missing cells, thus constructing three cell lines with no Gli. In this cell line, Sufu's nucleation is no longer induced by SHH induced.Sufu to recruit sin3a and HDAC to inhibit Gli transcriptional activity. We reconsidered this pattern and explored su. Fu can appear on the chromatin of the Gli binding site. We take the promoter of Gli1 and PTCH1 as an example, using the chip experiment, after the two loci are treated with Shh, the content of the Gli binding element increases, suggesting that Shh can induce Sufu to recruit to its target gene promoter region. Interestingly, we also found sap18 in Hh target gene promoter. HH These results suggest that Hh can induce the gli1-sufu complex to attach to its target gene promoter region, and that this is dependent on the Gli1 and Gli3 suppressors. In order to find the sequence originals that determine the distribution of Sufu in the cytoplasm and nucleus, we have made the missing location and finally determined the 308-318 residue of Sufu in human beings. The base had a potential NES signal. We mutated two of the leucine into alanine and detected in MEFs. Compared to the wild type sufu, the Sufu of the NES mutation appeared more in the nucleus. And the NES receptor CRM1 was no longer associated with the mutation of sufu. A pKa and GSK3 beta diphosphorylation site was reported before this laboratory. It is possible to regulate the stability of Sufu and the transport of the primary cilium. This diphosphorylation site is just near nes. In the CoIP experiment, we found that sufu, which can not be phosphorylated at 342 or 346 sites, has an effective binding ability with CRM1, and the simulated phosphorylation of Sufu loses its ability to bind with CRM1. Finally, we will have normal Su. Fu-GFP was co transfected with GSK-3 beta, PKA alone or two, and found that more Sufu was in the nucleus, but these kinases did not play a role in the non phosphorylated Sufu, that is, double A mutation. These results illustrate that Sufu can not only participate in Gli mediated transcription, inhibit the signaling pathway, but also enhance the nuclear transport of Gli1 protein. And stability, thus enhancing the activity of the Hh pathway, which is necessary for maximizing the activation of the Shh pathway. We have a new understanding of Sufu as a molecular chaperone of the Gli protein.
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R363

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本文編號：1962635