本文選題：生物起搏 + 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞��； 參考：《蘇州大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：第一部分:乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞和心室肌細(xì)胞的提取及其電生理特點(diǎn)的比較目的:對(duì)乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞和心室肌細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng),膜片鉗記錄乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞和心室肌細(xì)胞起搏電流(If)和動(dòng)作電位并比較其特點(diǎn),運(yùn)用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分析乳鼠心室肌If基因的表達(dá)。方法:通過(guò)酶消化法分離乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞和心室肌細(xì)胞,其中竇房結(jié)組織取自界嵴中部靜脈竇側(cè)、前腔靜脈根部,心室肌細(xì)胞取自乳鼠心室。用光鏡、膜片鉗記錄動(dòng)作電位等方法鑒定竇房結(jié)細(xì)胞和心肌細(xì)胞;用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞和乳鼠心肌細(xì)胞的If并研究其特性;采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞和乳鼠心室肌細(xì)胞If基因即超極化激活的環(huán)核苷酸門(mén)控通道(m HCN)亞型1、2和4的表達(dá)。結(jié)果:(1)通過(guò)酶消化法分離乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞和心室肌細(xì)胞,用光鏡、膜片鉗記錄動(dòng)作電位等方法鑒定;(2)培養(yǎng)3~5天,光鏡下可觀察到搏動(dòng)更快的梭形細(xì)胞,膜片鉗記錄動(dòng)作電位頻率為174.4±14.6bpm(n=20),證實(shí)為竇房結(jié)細(xì)胞。觀察到自發(fā)搏動(dòng)頻率較慢的多角形細(xì)胞,膜片鉗記錄動(dòng)作電位頻率為69.7±10.1bpm(n=20),證實(shí)為心室肌細(xì)胞。全細(xì)胞膜片鉗記錄到乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞和心室肌細(xì)胞的If,并分別得到電流-時(shí)間曲線(xiàn),竇房結(jié)細(xì)胞If電流的半最大激活電位約為-77.74m V,而乳鼠心室肌細(xì)胞If電流的半最大激活電位-93.58m V,竇房結(jié)細(xì)胞自律性顯著高于乳鼠心室肌細(xì)胞。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè),乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞的m HCN1:m HCN2:m HCN4為(4.16±0.19):(0.03±0.19):1,以m HCN4和m HCN1為主;乳鼠心室肌細(xì)胞的m HCN2:m HCN4為(4.62±0.23):1,未檢測(cè)到m HCN1表達(dá)。結(jié)論:乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞和心室肌細(xì)胞均有超極化激活的If電流,二者均表達(dá)HCN基因,竇房結(jié)細(xì)胞的自律性顯著高于乳鼠心室肌細(xì)胞,竇房結(jié)細(xì)胞主要表達(dá)m HCN4和m HCN1,心室肌細(xì)胞主要表達(dá)m HCN2和m HCN4,二者表達(dá)HCN基因亞型的差異可能是影響其自律性的重要因素之一。第二部分:慢病毒介導(dǎo)h HCN4轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建生物起搏模型目的:研究超極化激活環(huán)核苷酸門(mén)控陽(yáng)離子通道基因亞型4(h HCN4)轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs),與乳鼠心肌細(xì)胞共培養(yǎng)構(gòu)建心臟生物起搏器模型的可行性。方法:構(gòu)建包含h HCN4基因和綠色熒光蛋白的穿梭質(zhì)粒p CDH-GFP-h HCN4,并通過(guò)四質(zhì)粒系統(tǒng)包裝成慢病毒顆粒Lenti V-GFP-h HCN4,轉(zhuǎn)染大鼠的MSCs,構(gòu)建成h HCN4+MSCs;將僅有GFP基因的慢病毒顆粒Lenti V-GFP的MSCs設(shè)為對(duì)照組h HCN4-MSCs。通過(guò)熒光顯微鏡、RT-PCR以及Western-blot觀察鑒定h HCN4基因在MSCs中的表達(dá);Puro篩選轉(zhuǎn)染了h HCN4基因的MSC,獲得穩(wěn)定表達(dá)h HCN4的MSCs細(xì)胞株,膜片鉗記錄陽(yáng)性轉(zhuǎn)染細(xì)胞的起搏電流If。將各組MSCs與乳鼠心室肌細(xì)胞共培養(yǎng)構(gòu)建心臟生物起搏器模型,計(jì)數(shù)心室肌細(xì)胞自發(fā)搏動(dòng)頻率、記錄自發(fā)性動(dòng)作電位;加入縫隙連接阻斷劑甘珀酸觀察阻斷縫隙鏈接后乳鼠心肌細(xì)胞自發(fā)搏動(dòng)頻率的變化。結(jié)果:通過(guò)酶切電泳以及基因測(cè)序證明包含目的基因h HCN4的穿梭質(zhì)粒p CDH1-GFP-h HCN4構(gòu)建成功;通過(guò)四質(zhì)粒系統(tǒng)包裝成慢病毒顆粒Lenti V-GFP-h HCN4。通過(guò)慢病毒載體介導(dǎo)h HCN4基因轉(zhuǎn)染MSCs,轉(zhuǎn)染7天后,熒光、RT-PCR以及western blot證實(shí)h HCN4+MSCs中有h HCN4基因的表達(dá);膜片鉗記錄到h HCN4+MSCs上有時(shí)間和電壓依賴(lài)性的超極化激活的內(nèi)向電流,該電流符合If的特征,證明MSCs上已經(jīng)成功表達(dá)了有功能的起搏離子通道h HCN4。將h HCN4+MSCs與乳鼠心肌細(xì)胞共培養(yǎng)后,發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞的自發(fā)搏動(dòng)頻率明顯快于對(duì)照組中的心肌細(xì)胞自發(fā)搏動(dòng)頻率。膜片鉗結(jié)果顯示心肌細(xì)胞的自發(fā)動(dòng)作電位頻率顯著提高(70.5±8.2bpm vs.98.1±11.2bpm,P0.05,n=10);動(dòng)作電位頻率變規(guī)則;動(dòng)作電位最大舒張電位(MDP)絕對(duì)值降低(-84±4m V vs.-76±3m V,P0.05,n=10)。加入甘珀酸后實(shí)驗(yàn)組乳鼠心肌細(xì)胞自發(fā)搏動(dòng)頻率明顯下降。結(jié)論:h HCN4基因改造的MSCs可表達(dá)h HCN4基因,超極化下產(chǎn)生If電流;與心室肌細(xì)胞共培養(yǎng),成功構(gòu)建成具有自律性的心臟生物起搏器模型。第三部分:共轉(zhuǎn)染h HCN4和h HCN1改良生物起搏細(xì)胞目的:研究共轉(zhuǎn)染h HCN4和h HCN1基因構(gòu)建的生物起搏模型是否具有更高的生物起搏效率。方法:構(gòu)建包含h HCN1基因和紅色熒光蛋白的穿梭質(zhì)粒p CDH-RFP-h HCN1,并通過(guò)四質(zhì)粒系統(tǒng)包裝成慢病毒顆粒Lenti V-RFP-h HCN1。以Lenti V-RFP-h HCN1轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)h HCN4的MSCs,獲得共轉(zhuǎn)染h HCN4和h HCN1基因的MSCs。同時(shí)以Lenti V-RFP-h HCN1轉(zhuǎn)染未經(jīng)基因修飾的MSCs,以puro篩選,獲得穩(wěn)定表達(dá)h HCN1基因的MSCs。通過(guò)熒光顯微鏡、RT-PCR以及Western-blot觀察鑒定h HCN4基因在MSCs中的表達(dá)。膜片鉗檢測(cè)各組MSC上If電流。將各組MSCs與乳鼠心室肌細(xì)胞共培養(yǎng)構(gòu)建心臟生物起搏器模型,計(jì)數(shù)心室肌細(xì)胞自發(fā)搏動(dòng)頻率,記錄自發(fā)性動(dòng)作電位,記錄各組MSCs的If電流;加入縫隙連接阻斷劑甘珀酸觀察阻斷縫隙鏈接后乳鼠心肌細(xì)胞自發(fā)搏動(dòng)頻率的變化。結(jié)果:通過(guò)酶切電泳以及基因測(cè)序證明包含目的基因h HCN1的穿梭質(zhì)粒p CDH1-RFP-HCN4構(gòu)建成功;包裝慢病毒顆粒Lenti V-RFP-h HCN1。分別以慢病毒Lenti V-RFP-h HCN1轉(zhuǎn)染h HCN4+MSCs和未經(jīng)基因修飾的MSCs,獲得共轉(zhuǎn)染h HCN4和h HCN1基因的MSCs(HCN1+4組),僅轉(zhuǎn)染h HCN1基因的MSCs(HCN1組),第二部分中得到的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染h HCN4基因的MSCs為HCN4組,以及未行基因修飾的MSCs(對(duì)照組)。熒光、PCR以及western blot證實(shí)了HCN1+4組和HCN4組有h HCN4基因的表達(dá),HCN1+4組以及HCN1組有h HCN1基因的表達(dá)。在HCN4組、HCN1組以及HCN1+4組都可記錄到明顯的電壓與時(shí)間依賴(lài)性的超極化內(nèi)向電流,對(duì)照組無(wú)相應(yīng)電流表達(dá)。將各組MSCs與乳鼠心肌細(xì)胞共培養(yǎng),HCN1+4組乳鼠心肌細(xì)胞自發(fā)搏動(dòng)頻率(138.1±11.5bpm)較HCN1組(96.3±7.5bpm)和HCN4組(99.1±8.7bpm)均更高(p0.05,n=10),HCN1+4組的最大復(fù)極電位(-69.6±3.7m V)較HCN1組(-75.9±5.2m V)和HCN4組(-75.2±1.9m V)均更低,HCN1+4組4期自動(dòng)去極化速率(55.2±8.9 m V/s)較HCN1組(33.4±2.4 m V/s)和HCN4組(33.8±5.3 m V/s)更快。加入甘珀酸后,三組乳鼠心肌細(xì)胞的自發(fā)搏動(dòng)頻率均明顯減慢。結(jié)論:與單獨(dú)轉(zhuǎn)染hHCN1或hHCN4基因相比,共轉(zhuǎn)染hHCN1和hHCN4構(gòu)建的生物起搏器模型具有更高的自律性。第四部分:共轉(zhuǎn)染h HCN1和h HCN4后If電流的電生理特點(diǎn)及其提高生物起搏模型自律性的機(jī)制目的:全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄穩(wěn)定共轉(zhuǎn)染h HCN1和h HCN4基因的MSCs,并與h HCN1組和h HCN4組進(jìn)行比較,比較各組If電流的特點(diǎn),探討共轉(zhuǎn)染h HCN1和h HCN4基因改善生物起搏模型自律性的機(jī)制。方法:全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄穩(wěn)定轉(zhuǎn)染h HCN1基因、h HCN4基因以及共轉(zhuǎn)染h HCN1和h HCN4基因的MSCs,觀察If電流時(shí)間曲線(xiàn),電壓依賴(lài)性穩(wěn)態(tài)激活曲線(xiàn)以及通道激活時(shí)間常數(shù)曲線(xiàn),比較各組間If電流密度的差異。以c AMP、Cs+、以及伊伐布雷定分別灌流,觀察它們對(duì)各組If電流的影響。結(jié)果:各組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MSCs均可記錄到一系列超極化內(nèi)向離子流(If電流),各組電流均成電壓時(shí)間依賴(lài)性。Ih HCN1半最大激活電位V1/2為-92.27±0.53m V;Ih HCN4半最大激活電位V1/2為-102.09±0.72m V;Ih HCN1+4半最大激活電位V1/2為-90.88±0.48m V。Ih HCN4半最大激活電位電位顯著較Ih HCN1和Ih HCN1+4更負(fù)。測(cè)試電位-90m V時(shí),Ih HCN1電流密度為-11.6±6.01p A/p F,Ih HCN4電流密度為-20.5±5.46p A/p F,Ih HCN1+4電流密度為-59.9±8.02p A/p F,Ih HCN1+4電流密度最高,Ih HCN4次之,Ih HCN1最低。三組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=10,p0.05)。測(cè)試電位-90m V時(shí),Ih HCN1激活時(shí)間為150±27.31ms,Ih HCN4激活時(shí)間為920±86.9ms,Ih HCN1+4激活時(shí)間為140±18.02ms,Ih HCN4激活時(shí)間要顯著長(zhǎng)于Ih HCN1和Ih HCN1+4(n=10,p0.05),而Ih HCN1和Ih HCN1+4激活時(shí)間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=10,p0.05)。電極內(nèi)液中加入終濃度為100μmol/L的c AMP后,Ih HCN1+4的V1/2從加c AMP前的-90.88±0.48m V,向正向移動(dòng)至-83.39±0.20m V,正向移動(dòng)約11m V(n=10,p0.05);c AMP使Ih HCN1+4激活明顯加快,測(cè)試電壓-90m V時(shí),加入c AMP前Ih HCN1+4的激活時(shí)間為140±18.02ms,加入c AMP后,Ih HCN1+4的激活時(shí)間縮短為84±14.42ms(n=10,p0.05)。Cs+可阻斷If,其Ih HCN1+4對(duì)半效抑制濃度為125.8±14.9μmol/L,4mmol/L Cs+對(duì)Ih HCN1+4的抑制在洗脫后可部分恢復(fù)。伊伐布雷定可抑制Ih HCN1+4,IC50為1.07±0.039μmol/L,5μmol/L伊伐布雷定對(duì)Ih HCN1+4的抑制在洗脫后可完全恢復(fù)。結(jié)論:共轉(zhuǎn)染了h HCN1和h HCN4基因的MSCs,其表達(dá)的Ih HCN1+4電流密度較Ih HCN4和Ih HCN1+4更高,激活速度較Ih HCN4更快,和Ih HCN1相當(dāng)。構(gòu)建的生物起搏細(xì)胞可被神經(jīng)體液因素調(diào)控,c AMP可加速其激活,Cs+以及伊伐布雷定可阻斷。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果為h HCN1和h HCN4共轉(zhuǎn)染改良生物起搏模型提供了理論依據(jù),為將來(lái)生物起搏細(xì)胞運(yùn)用于臨床奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R-332;R541.7

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本文編號(hào)：1922815