本文選題：TcpC + 樹突狀細(xì)胞　； 參考：《浙江大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：背景和目的樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)是迄今為止體內(nèi)功能最強大的專職抗原提呈細(xì)胞,廣泛分布于外周組織中。正常情況下體內(nèi)絕大多數(shù)DC都處于未成熟狀態(tài),未成熟的DC可通過其表面受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用、巨吞飲作用以及吞噬作用等方式攝取抗原,在攝取抗原后或受到某些刺激(如炎性信號LPS、IL-1β、TNF-α)后,未成熟的DC即開始分化成熟。DC的抗原提呈功能可直接或間接激活T、B細(xì)胞,因此DC在免疫應(yīng)答中占據(jù)獨特地位,對DC的深入研究有助于我們了解機(jī)體免疫應(yīng)答的發(fā)生和調(diào)控機(jī)制,對腫瘤、移植排斥、感染、自身免疫病等發(fā)生發(fā)展機(jī)制及治療也具有重要的理論意義和實際意義。Toll樣受體(Toll like receptors,TLRs)是一類結(jié)構(gòu)功能較為明確的模式識別受體,在多種組織和細(xì)胞中廣泛分布,并且在一些固有免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、DCs中表達(dá)較高,TLRs可以通過識別并結(jié)合病原體的相關(guān)模式分子(pathogen associated molecular pattern,PAMP)來活化免疫細(xì)胞并表達(dá)一系列的免疫效應(yīng)分子,在免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。尿路感染(urinary tract infection,UTI)是由各種病原體入侵泌尿系統(tǒng)、侵犯尿路黏膜或者尿路組織而引發(fā)的尿路炎癥,臨床特征一般表現(xiàn)為腰痛、尿頻、尿急、尿痛,引起泌尿系統(tǒng)炎癥的致病菌大部分為腸道的大腸埃希菌。針對尿路感染目前多采用抗生素類藥物進(jìn)行治療,但隨著病原菌耐藥性的增加給尿路感染的治療帶來了極大挑戰(zhàn)。TcpC是由尿路致病性大腸埃希菌CFT073菌株分泌的一種含有TIR(Toll/interleukin-1 receptor)結(jié)構(gòu)域的蛋白,因其TIR結(jié)構(gòu)域與TLR的TIR結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)相似,因此TcpC可以直接與TLR信號通路的接頭蛋白髓樣分化因子 88(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)結(jié)合,從而阻斷 TLR 信號通路,干擾機(jī)體正常的免疫應(yīng)答。目前關(guān)于TcpC干擾機(jī)體免疫應(yīng)答的研究多集中于巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及上皮細(xì)胞,尚無TcpC對樹突狀細(xì)胞分化和功能影響的研究報道。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn),TcpC能夠抑制DC的分化成熟以及MHC(maj or histocompatibility complex,MHC)Ⅱ類分子途徑對抗原的提呈。本課題擬研究TcpC調(diào)控樹突狀細(xì)胞的作用機(jī)制,旨在為進(jìn)一步闡明TcpC介導(dǎo)的免疫逃逸機(jī)制提供新的實驗依據(jù)。方法1 TcpC蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)凍融已鑒定好的含TcpC基因片段的工程菌E.coli BL21pET42a-TcpC并劃線接種于含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后從平板上挑取單個分離良好的、直徑約為2-3mm的白色半透明菌落于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37℃220rpm振蕩培養(yǎng)過夜。吸取過夜后的菌液1ml并加至含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37℃ 220rpm振蕩培養(yǎng)至OD值為0.6-0.8,加入IPTG,37℃220rpm振蕩培養(yǎng),誘導(dǎo)TcpC蛋白的表達(dá)。2 TcpC蛋白的純化濃縮采用鎳柱分離純化、超濾管濃縮的方法。3兔抗TcpC多克隆抗體的制備將濃縮后的TcpC蛋白與弗氏佐劑及弗氏不完全佐劑等量混合乳化至"油包水"狀態(tài),初次免疫之前要先進(jìn)行耳緣靜脈采血作為陰性對照,初次免疫之后的第三周開始加強免疫,每周一次共三次。末次免疫10天后先采少量血進(jìn)行效價測定。4兔抗TcpC多克隆抗體效價的測定采用雙向瓊脂擴(kuò)散的方法進(jìn)行測定。5兔抗TcpC多克隆抗體的純化效價達(dá)到要求后,對家兔進(jìn)行頸動脈采血,收集獲得的血液并分離血清,再采用飽和硫酸銨法純化血清中的免疫球蛋白IgG。6兔抗TcpC多克隆抗體的特異性檢測Western blotting檢測制備的抗體對已純化的TcpC蛋白以及CFT073菌株分泌的TcpC天然蛋白的特異性,同時用TcpC基因敲除株TcpC-/-作為對照。7檢測DCs能否攝取TcpC蛋白收集DC2.4,洗滌后配成3×105 cells/ml鋪于Transwell 24孔板的下室,1ml/孔;上室加3×106個細(xì)菌(MOI=細(xì)菌數(shù):細(xì)胞數(shù)=10:1)。以3種方式處理:空白對照組,即DC2.4組;DC2.4+TcpCwt組;DC2.4+TcpC-/-組,每組做3個復(fù)孔。在不同的時間點收集細(xì)胞,裂解細(xì)胞并獲取胞內(nèi)蛋白,用制備的兔抗TcpC多克隆抗體進(jìn)行western blotting檢測。8檢測TcpC蛋白進(jìn)入DCs胞內(nèi)后的作用機(jī)制收集DC2.4,洗滌后配成3×105 cells/ml并鋪于Transwell 24孔板的下室,1ml/孔;上室加3×106個細(xì)菌(MOI=細(xì)菌數(shù):細(xì)胞數(shù)=10:1)。以3種方式處理:空白對照組,即DC2.4組;DC2.4+TcpCwt組;DC2.4+TcpC-/-組,每組做3個復(fù)孔。16h后收集細(xì)胞,裂解細(xì)胞并獲取胞內(nèi)蛋白,用MyD88及p65 磷酸化抗體進(jìn)行western blotting檢測。結(jié)果1加入IPTG至終濃度為O.1mM,37℃ 220rpm振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)6-7h后TcpC目的蛋白即大量表達(dá),并且主要以包涵體的形式表達(dá)。2咪唑濃度為2mM時即可將TcpC蛋白洗脫下來,將純化后的TcpC蛋白濃度濃縮至2mg/ml并對家兔進(jìn)行免疫。3采用雙向瓊脂擴(kuò)散法測定抗體效價為1:8,對家兔進(jìn)行頸動脈采血。4 Western blotting檢測抗血清對TcpC目的蛋白及天然蛋白均有單一清晰條帶,且對照株即TcpC基因敲除的菌株未見條帶。5將DCs和細(xì)菌transwell隔開共培養(yǎng)不同的時間點檢測DCs胞內(nèi)的蛋白情況,發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)8h時DCs胞內(nèi)即出現(xiàn)TcpC蛋白,隨時間變長DCs胞內(nèi)的TcpC蛋白逐漸增多,至16h時達(dá)到最多,20h、24h時又出現(xiàn)減少情況。6將DCs和細(xì)菌transwell隔開共培養(yǎng)同時設(shè)置對照,發(fā)現(xiàn)與CFT073菌株共培養(yǎng)的DCs胞內(nèi)的MyD88蛋白及p-p65蛋白的量明顯低于空白對照組及與敲除株共培養(yǎng)的DCs。結(jié)論TcpC蛋白可以被DC攝取,進(jìn)入DC后可以引起MyD88蛋白的降解并抑制NF-kBp65蛋白的磷酸化,從而干擾TLR信號通路。
[Abstract]:Dendritic cells ( DCs ) are the most powerful antigen - presenting cells in vivo and are widely distributed in peripheral tissues . In this study , TcpC polyclonal antibody was isolated and purified by two - way agar diffusion method . The results showed that TcpC could inhibit the differentiation of TcpC and the effect of MHC class 鈪，

本文編號：1921099