本文選題：原位活體分析 + 熒光標(biāo)記　； 參考：《武漢大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：對(duì)復(fù)雜生物體系進(jìn)行實(shí)時(shí)、原位和活體分析是分析化學(xué)發(fā)展的重點(diǎn)和難點(diǎn)。病毒相關(guān)疾病嚴(yán)重威脅著人類(lèi)健康,因此全面深入地了解病毒侵染機(jī)制,對(duì)病毒性疾病的預(yù)防、早期診斷和治療具有重大意義。病毒的熒光標(biāo)記技術(shù)及單顆粒示蹤技術(shù)為研究病毒的侵染機(jī)制提供了強(qiáng)有力的工具。量子點(diǎn)具有優(yōu)越的熒光性質(zhì),在長(zhǎng)時(shí)間病毒單顆粒示蹤方面是一種非常理想的熒光標(biāo)記物。然而,已有的量子點(diǎn)標(biāo)記病毒策略大都以病毒外部包膜作為標(biāo)記位點(diǎn),無(wú)法用于示蹤病毒脫去包膜后的侵染事件,因此需要發(fā)展一種量子點(diǎn)標(biāo)記病毒衣殼的策略。另外,以往對(duì)病毒侵染機(jī)制的研究缺乏系統(tǒng)性和整體性,也極少提供病毒侵染行為的動(dòng)態(tài)信息,因而需要發(fā)展一套能夠系統(tǒng)闡述病毒整個(gè)侵染過(guò)程的動(dòng)態(tài)示蹤方法。病毒的三個(gè)關(guān)鍵組分(病毒包膜、衣殼和核酸)都參與病毒侵染過(guò)程,然而目前僅實(shí)現(xiàn)了病毒雙組分的同時(shí)標(biāo)記,無(wú)法全面而細(xì)致地探索病毒的整個(gè)侵染機(jī)制。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)能夠?qū)⒁环N或多種外源基因表達(dá)在包膜或衣殼上,為實(shí)現(xiàn)病毒衣殼的量子點(diǎn)標(biāo)記及病毒多組分的同時(shí)標(biāo)記提供了可能性。論文針對(duì)已有的病毒標(biāo)記策略及其在病毒侵染機(jī)制研究方面的不足,以具有典型三組分結(jié)構(gòu)的桿狀病毒為模式病毒,利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì),主要研究?jī)?nèi)容如下：建立了一種用量子點(diǎn)定點(diǎn)標(biāo)記包膜病毒衣殼的策略。利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng),病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制中實(shí)現(xiàn)了其衣殼蛋白VP39的生物素化,繼而衣殼被鏈霉親和素修飾的量子點(diǎn)定點(diǎn)標(biāo)記。該標(biāo)記避免了常規(guī)的劇烈化學(xué)反應(yīng),因此病毒侵染性得到了很好的保持。由于VP39是主要的衣殼蛋白,該標(biāo)記具有很高的標(biāo)記效率(約為95%)。這種包膜病毒內(nèi)部衣殼的量子點(diǎn)標(biāo)記為同時(shí)示蹤病毒脫去包膜前和脫去包膜后的過(guò)程奠定了良好基礎(chǔ)。發(fā)展了一種系統(tǒng)地示蹤病毒侵染全過(guò)程的方法�；谝職け涣孔狱c(diǎn)標(biāo)記的桿狀病毒及單顆粒示蹤技術(shù),分別示蹤了桿狀病毒與囊泡、酸性?xún)?nèi)涵體、肌動(dòng)蛋白及核孔等與病毒侵染過(guò)程密切相關(guān)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)之間的相互作用,從而闡明了桿狀病毒從吸附到細(xì)胞膜到進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)經(jīng)歷的五個(gè)階段,并提供了病毒的運(yùn)動(dòng)模式及運(yùn)動(dòng)參數(shù)。該方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)病毒整個(gè)侵染過(guò)程的動(dòng)態(tài)示蹤,為研究病毒的整個(gè)侵染機(jī)制提供了可能性。建立了一種同時(shí)定點(diǎn)標(biāo)記病毒包膜、衣殼和核酸的方法。利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)同時(shí)實(shí)現(xiàn)了桿狀病毒包膜蛋白的生物素化和衣殼蛋白的GFP標(biāo)記,結(jié)合核酸染料SYTO 82及SA-QDs對(duì)宿主細(xì)胞的孵育,使桿狀病毒多組分的同時(shí)標(biāo)記在病毒自我復(fù)制過(guò)程中實(shí)現(xiàn),避免了分別標(biāo)記各組分和除去多余標(biāo)記物的繁瑣操作,最大限度保持了病毒侵染性。病毒蛋白的定點(diǎn)改造以及SYTO 82與核酸之間極強(qiáng)的結(jié)合力使各組分都被定點(diǎn)且高效地標(biāo)記(標(biāo)記效率約為90%)。基于該標(biāo)記獲得了病毒各個(gè)組分在細(xì)胞內(nèi)的分離以及轉(zhuǎn)運(yùn)信息,為病毒侵染機(jī)制全面而細(xì)致的研究以及病毒性疾病的預(yù)防和診治提供了可能性。
[Abstract]:In this paper , we have developed a new method for detecting virus infection by using baculovirus expression system , which has the advantages of high labeling efficiency ( about 95 % ) .

【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R373;O657.3

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本文編號(hào)：1892419