本文選題：曼氏迭宮絳蟲 + 裂頭蚴�。� 參考：《鄭州大學》2017年碩士論文

【摘要】：迭宮屬絳蟲的中絳期幼蟲——裂頭蚴,可寄生于人體引起裂頭蚴病,主要表現(xiàn)為幼蟲移行癥,累及全身,可導致失明、肢體麻痹、甚至死亡。裂頭蚴病呈世界性分布,但多見于東亞及東南亞國家。我國大部分地區(qū)均有人體裂頭蚴病報道,累計超過1 000例,病例數(shù)為世界之最。近年來,裂頭蚴病的發(fā)病趨勢在部分地區(qū)呈上升態(tài)勢,已被列為新現(xiàn)的動物源性寄生蟲病。對我國的裂頭蚴種群進行遺傳結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)生生物地理學研究,不僅對于了解我國迭宮絳蟲種群的歷史演化過程有基礎性理論意義,而且對揭示它們?nèi)绾雾憫獨夂蜃兓铜h(huán)境變遷,從而對制定裂頭蚴病有效的防制策略具有指導意義。然而,目前關于我國裂頭蚴的種群遺傳多樣性其分化模式等方面的研究還較薄弱。本研究利用公共數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)有的歐猥迭宮絳蟲(Spirometra erinaceieuropaei)成蟲及裂頭蚴的ESTs開發(fā)了4個多態(tài)性微衛(wèi)星分子標記,并利用這4個位點對我國西南11個地區(qū)的裂頭蚴類群進行了種群遺傳多態(tài)性研究。材料與方法1.裂頭蚴標本采集及鑒定:2014年5月至2015年9月,對我國四川、重慶和云南11個地區(qū)野生蛙體內(nèi)裂頭蚴的自然感染情況進行調(diào)查,并對陽性蛙體的裂頭蚴進行收集,用無水乙醇密閉保存。利用通用型柱式基因組DNA提取試劑盒提取每一株標本的基因組DNA,基于cox1分子標記對采集的地理株進行分子生物學鑒定。2.微衛(wèi)星分子標記開發(fā):首先利用NCBI_BLAST和UniVec數(shù)據(jù)庫掩蔽獲取自公共數(shù)據(jù)庫裂頭蚴相關ESTs中冗余序列,然后使用CD_HIT_EST在線工具對ESTs聚類,最后利用MISA遵照單核酸重復10次及以上、2核苷酸和3核苷酸4次及以上、4核苷酸及5核苷酸和6核苷酸3次及以上、長度在100bp內(nèi)的標準查找微衛(wèi)星位點。選擇以3核苷酸和(或)4核苷酸模式為主且位點側(cè)翼序列符合引物設計要求的微衛(wèi)星作為目的序列。利用Primer3設計目的序列引物,通過小樣本預實驗利用溫度梯度PCR、瓊脂糖凝膠電泳和PCR產(chǎn)物測序來檢測擴增序列與原位點序列的一致性和多態(tài)性。3.目的序列擴增和測序:對確定與原位點序列一致且具有多態(tài)性的引物利用預實驗確定的PCR條件和體系對所有地理株進行有效擴增,擴增產(chǎn)物一部分進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳加硝酸銀染色(即PAGE銀染),另一部分進行微衛(wèi)星序列測序。4.PAGE及微衛(wèi)星序列數(shù)據(jù)處理:對于銀染數(shù)據(jù),使用GenePop在線模塊估算HO(觀測雜合度)、HE(期望雜合度)、H(基因多樣性)、哈德溫伯格平衡和連鎖不平衡檢驗、群體內(nèi)近交系數(shù)Fis、固定系數(shù)Fst和總體近交系數(shù)Fit;使用Arlequin 3.5計算遺傳分化指數(shù)FST和G-W指數(shù)(Garza-Williamson index);使用GenALEx 6.5進行分子變異分析(AMOVA)和主坐標分析(PCoA)。對于測序數(shù)據(jù),使用MEGA v.6.06進行序列比對并對比對結(jié)果進行人工校正;使用DnaSP v.5.10進行單倍型(Haplotype)分析并分別構(gòu)建不同微衛(wèi)星標記的單倍型矩陣及多標記聯(lián)合矩陣。5.遺傳多態(tài)性分析:使用DnaSP v.5.10計算各地理群的單倍型多態(tài)性及核苷酸多態(tài)性;使用Network v.4.5對各個微衛(wèi)星標記及聯(lián)合序列進行單倍型網(wǎng)絡的重建;分別使用最大簡約、最大似然及貝葉斯推斷法進行系統(tǒng)發(fā)育分析。最大簡約分析在MEGA v.6.06中進行,樹的搜索策略采用啟發(fā)式搜索,分支交換法采用樹二等分再連接的分支交換法,系統(tǒng)樹每一分枝的置信度采用自引導法重復檢驗,設置2000次重復;使用PhyML軟件進行最大似然分析,基因進化模型用赤池信息量準則在jModelTest 2中選擇模型,分枝的置信度采用自引導法重復檢驗,設置2000次重復;采用MrBayes v3.1進行貝葉斯分析,運行1×108代,每100代對系統(tǒng)樹進行抽樣,使用收斂診斷法對穩(wěn)定性進行重新評估,當分離頻率的平均標準差小于0.02時則認為兩次運行之間存在收斂。所有系統(tǒng)發(fā)育分析均運算兩次。使用Arlequin3.5中岐點分布分析來評估裂頭蚴種群的動態(tài)變化,并基于中性選擇理論,對不同種群進行Fu’s FS檢測和Tajima’s D檢測。結(jié)果1.中國西南地區(qū)野生蛙類裂頭蚴自然感染率:自中國西南11個不同地區(qū)(四川南充、營山、廣安、樂山、自貢、瀘州、達州、涼山州和云南昆明、保山及重慶梁平)共采集野生蛙類347只,經(jīng)鑒定均為黑斑蛙(Rana nigromaculata)。其中64只感染裂頭蚴,平均感染率為18.44%。不同地區(qū)裂頭蚴感染率從6.67%到36.36%不等,最多的1只感染31裂頭蚴,最少的感染1條。四川地區(qū)蛙類裂頭蚴感染率較高,其中又以南充的感染率最高,達36.36%。2.微衛(wèi)星位點篩選和引物設計:共獲得12 481條裂頭蚴相關ESTs,找到符合要求的微衛(wèi)星915條,平均約1 779個堿基中含有1條微衛(wèi)星位點。重復單元以單核苷酸為最多,占46.67%,其中重復大于15次的長序列以A/T模式為主,小于15次的短序列以C/G為主;其次是2核苷酸,占31.26%,又以AC/GT和AG/CT豐度最高;再次是3核苷酸分別為16.72%,數(shù)量最多的是AGG/CCT模式;最后是占4.48%的4核苷酸模式以及合計不足1%的5核苷酸和6核苷酸。通過小樣本預實驗從15個位點中篩選出了5個(C07、M15、I03、N11和M20)與預期位點序列一致的微衛(wèi)星分子標記,經(jīng)測序驗證其中4個(C07、M15、N11和M20)具有多態(tài)性。3.基于PAGE銀染數(shù)據(jù)的遺傳多態(tài)性分析:5個微衛(wèi)星標記和64株裂頭蚴地理株共鑒定出13個等位基因,每個微衛(wèi)星標記所鑒定出的等位基因數(shù)量為2~3個(平均2.60)。95%的地理株等位基因數(shù)不超過3個,平均每個地理株每個微衛(wèi)星位點的等位基因數(shù)為1.89。I03位點上的雜合數(shù)量最少,只有18.75%,其次是N11位點,占26.56%。四川廣安和南充地區(qū)具有最多的等位基因數(shù)(11個),平均等位基因數(shù)也最高(2.20),而四川達州和云南昆明的平均等位基因數(shù)最少(1.40),四川樂山在5個位點上均表現(xiàn)出多態(tài)性。所有地理株整體上總雜合度范圍為0~0.682(平均值為0.322),每個地理種群觀測雜合度(HO)的均值為0.436(范圍為0~1.000)。哈德溫伯格平衡檢驗結(jié)果表明本研究的所有地理株是一個整體種群中的隨機個體(P0.05),且所選的微衛(wèi)星位點之間不存在連鎖不平衡(P0.05)。估算的Fis和Fit結(jié)果均為負值,表明群體觀測雜合度大于期望雜合度,群體內(nèi)存在雜交情況。在N11位點上群體間遺傳分化較弱(Fst0.05),I03位點上群體間遺傳分化較強(Fst0.25),C07、M20和M15為中等(0.05Fst0.15),所有位點上群體間遺傳分化處于中等水平(0.05Fst0.15)。而各地理群G-W指數(shù)平均值均大于臨界值0.68,表明整體上種群比較穩(wěn)定,不存在種群擴張事件。AMOVA結(jié)果顯示變異主要來樣本個體之間,占總體的93%,在地理群之間的變異較小,只占7%。利用遺傳距離和地理距離進行的PCoA分析顯示云南保山、昆明地理群與四川各地理群及重慶梁平間差距明顯,總體上可分為云南與四川+重慶兩個大的群體。在地理株的水平上,云南昆明、保山和四川達州間存在部分重疊,但不與其它地理群重疊,除達州外的四川各地理群之間和重慶梁平間均有重疊存在。4.基于序列的遺傳多態(tài)性分析:通過序列比對發(fā)現(xiàn)I03的多態(tài)性來自微衛(wèi)星位點的側(cè)翼序列上,因此在基于微衛(wèi)星序列數(shù)據(jù)進行遺傳多態(tài)性分析時剔除了I03位點。在剩余的4個位點中,基于C07標記共鑒定出4個單倍型,其中Hap1涵蓋17個地理株,Hap2涵蓋41個地理株,Hap3涵蓋5個地理株,Hap4只包含1個地理株;M15標記共鑒定出9個單倍型,其中Hap1涵蓋46個地理株,Hap4涵蓋9個地理株,Hap6和Hap8分別包含2個地理株,Hap2、Hap3、Hap5、Hap7和Hap9均只有1個地理株;M20標記共鑒定出7個單倍型,其中Hap1涵蓋10個地理株,Hap2和Hap7均涵蓋2個地理株,Hap3包含30個地理株,Hap4涵蓋13個地理株,Hap5涵蓋6個地理株,Hap6只包含1個地理株;N11標記共鑒定出10個單倍型,其中Hap1涵蓋21個地理株,Hap2包含18個地理株,Hap3包含6個地理株,Hap4涵蓋9個地理株,Hap9涵蓋3個地理株,Hap8和Hap10均涵蓋2個地理株,Hap5、Hap6和Hap7均只有1個地理株;C07、M15、M20和N11總的單倍型多態(tài)性(Hd)及核苷酸多態(tài)性(Pi)分別為:0.175±0.061、0.00090±0.00032,0.468±0.072、0.01559±0.01007,0.553±0.057、0.00430±0.00062,0.581±0.064、0.00494±0.00077。分子差異度分析的結(jié)果顯示種群之間的遺傳差異度比種群內(nèi)的要高。分別使用最大簡約法、最大似然法和貝葉斯推斷法對不同微衛(wèi)星標記進行的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明,所有微衛(wèi)星標記的單倍型均分為兩個主要分枝,其中,C07標記的Hap4單獨形成一個分枝;M15標記的Hap4和Hap5形成一個分枝;M20標記的Hap2和Hap5形成一個分枝;N11標記的Hap3、Hap4、Hap6和Hap7共同形成一個類群。基于單倍型的中接鄰接網(wǎng)絡分析的結(jié)果也顯示西南地區(qū)裂頭蚴的存在兩個單倍型子網(wǎng)絡,并且與系統(tǒng)進化樹上的分枝相對應。其中,C07標記的Hap2是最主要的單倍型,頻數(shù)為41;M15標記的Hap1是最主要的單倍型,頻數(shù)為46;M20標記的Hap3是最主要的單倍型,頻數(shù)為30;N11標記的Hap1和Hap2是最主要的單倍型,頻數(shù)分別為21和18。結(jié)論1.我國西南地區(qū)野生黑斑蛙體內(nèi)均存在裂頭蚴自然感染情況,平均感染率為18.44%;2.基于歐猥迭宮絳蟲成蟲和裂頭蚴的EST序列數(shù)據(jù)庫,利用生物信息工具成功篩選出4組微衛(wèi)星標記:C07、M15、M20和N11;3.PCoA分析結(jié)果表明我國西南地區(qū)裂頭蚴存在2個種群,且地理隔離對裂頭蚴的種群遺傳多態(tài)性影響較大;4.基于不同微衛(wèi)星標記的單倍型分析結(jié)果表明,我國西南地區(qū)裂頭蚴種群的基因多態(tài)性水平較低;5.系統(tǒng)發(fā)育及單倍型網(wǎng)絡分析結(jié)果均提示西南地區(qū)裂頭蚴種群存在2種基因型,且這2種基因型在不同地理區(qū)域混合存在。
[Abstract]:In recent years , the research on the genetic structure and systematic biogeography of the population genetic diversity in China ' s Sichuan , Chongqing and Yunnan has been reported . Genetic polymorphism analysis was carried out by using DnaSP v.5 . 10 . The results showed that the number of alleles per microsatellite marker was only 18.75 % , and the number of alleles per microsatellite locus was at least 1 % . The number of alleles per microsatellite marker was 1 . 89 . Based on the genetic polymorphism analysis , there were only one geographic strain in the population , including two geographical strains , Hap2 , Hap3 , Happi5 , Happi7 and Hapten . The results of phylogenetic analysis showed that there were two main branches of C07 - labeled Hap3 , 0 . 01559 鹵 0 . 00032 , 0 . 468 鹵 0.072 , 0 . 01559 鹵 0 . 01007 , 0 . 553 鹵 0 . 057 , 0 . 00430 鹵 0 . 00062 , 0 . 581 鹵 0 . 064 , 0 . 00494 鹵 0 . 00077 .

【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R383.35
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本文編號：1831033