發(fā)布時間：2018-05-01 14:24

  本文選題：腦膜炎奈瑟氏菌 + fHbp�。� 參考：《吉林大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：腦膜炎是由腦膜炎奈瑟氏菌引發(fā)的世界性傳染病,具有高致死率、高傳染性等特點(diǎn),尤其對6個月至2周歲的嬰兒具有極大易感性,即使痊愈也會留下永久性的神經(jīng)后遺癥。目前防治腦膜炎最有效的方法仍是接種疫苗。針對5種主要的致病血清型,已開發(fā)并批準(zhǔn)了4種莢膜多糖結(jié)合疫苗的使用,即A、C、W和Y等四種。但血清型B的腦膜炎球菌因其多糖結(jié)構(gòu)與人體組織的唾液酸同源,無法引起免疫反應(yīng),故缺乏有效的多糖疫苗。以fHbp為主要候選抗原的出現(xiàn),為預(yù)防和控制B型腦膜炎(Men B)疫苗的開發(fā)和利用提供了一條有效的途徑。本研究利用基因工程手段,從溫州醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院的一例B型腦膜炎患者中分離了一株Men B毒株中克隆fHbp基因,經(jīng)生物信息學(xué)分析后構(gòu)建原核表達(dá)載體p ET-22b-fHbp。熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,獲得工程菌。確定當(dāng)誘導(dǎo)溫度為37℃,誘導(dǎo)劑IPTG的濃度為500m M,誘導(dǎo)時間為8hr的條件下,外源蛋白fHbp表達(dá)量達(dá)到最大值,約為總可溶性蛋白的20%,且為可溶性蛋白形式。經(jīng)Ni2+Sepharose Fast Flow親和層析純化后獲得了大腸桿菌表達(dá)的fHbp純品,命名為E-fHbp。針對擬南芥密碼子偏好性,對fHbp基因序列進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)和化學(xué)合成。構(gòu)建以菜豆Pha P啟動子驅(qū)動密碼子優(yōu)化后的fHbp基因的植物表達(dá)載體p Pha P3301-rfHbp。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的沾花侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥,經(jīng)濃度為1%的除草劑Basta篩選后共計(jì)獲得300余株抗性植株,金標(biāo)免疫試紙條(PAT/bar試紙條)檢測結(jié)果288株陽性植株。進(jìn)一步對抗性植株中的rfHbp基因進(jìn)行PCR鑒定,共計(jì)獲得87株陽性植株。對全部87株T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥種莢中的目的蛋白進(jìn)行ELISA檢測,篩選出5株fHbp表達(dá)量在0.1%以上的轉(zhuǎn)基因株系。Southern檢測表明,r HF-10、r HF-22和r HF-54三個植株為單拷貝插入,而Western和ELISA檢測表明,r HF-22中目的蛋白的表達(dá)量最高為種子總可溶蛋白的0.349±0.072%。經(jīng)Ni2+Sepharose Fast Flow親和層析純化,獲得了植物源fHbp蛋白純品,命名為A-fHbp。將上述實(shí)驗(yàn)中獲得的不同來源的fHbp蛋白進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn),通過腹腔注射接種E-fHbp和A-fHbp,比較了兩種不同來源的候選疫苗的免疫原性差異,結(jié)果表明E-fHbp與A-fHbp誘導(dǎo)血清特異抗體滴度分別達(dá)到4.2×104和4.8×104,且能夠誘導(dǎo)乳兔補(bǔ)體產(chǎn)生SBA活性。對兩種不同來源的fHbp蛋白進(jìn)行小鼠Bal B/c的口服免疫實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明兩者均未誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生出粘膜Ig A。小鼠攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明,E-fHbp對小鼠的保護(hù)率為76.67%,A-fHbp的保護(hù)率為80%,兩者在作為候選疫苗的保護(hù)效果無顯著差異。本研究首次完成fHbp蛋白在轉(zhuǎn)基因植物種子中的表達(dá)與分離純化工作,并比較了兩種不同來源的fHbp蛋白在免疫學(xué)方面的差異,結(jié)果表明兩者無顯著差異,均具備候選疫苗的潛力。本研究為植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)蛋白亞基疫苗提供借鑒,尤其是為B亞型腦膜炎奈瑟氏菌候選疫苗的研究和開發(fā)提供了重要理論依據(jù)。
[Abstract]:Meningitis is a worldwide infectious disease caused by Neisseria meningitidis. It has the characteristics of high mortality and high infectivity. It is especially susceptible to infants aged 6 months to 2 years old. Vaccination is still the most effective way to prevent and treat meningitis. For five major pathogenic serotypes, four kinds of capsular polysaccharide conjugate vaccines were developed and approved. However, meningococcus serotype B has no immune response because its polysaccharide structure is homologous to sialic acid in human tissues, so it lacks an effective polysaccharide vaccine. The emergence of fHbp as the main candidate antigen provides an effective way to prevent and control the development and utilization of Meningitis B vaccine. In this study, fHbp gene was cloned from a Men B strain from a patient with type B meningitis in the first affiliated Hospital of Wenzhou Medical University by genetic engineering. The prokaryotic expression vector pET-22b-fHbpwas constructed by bioinformatics analysis. E. coli BL21 DDE3) was transformed by heat shock method to obtain engineering bacteria. When the induction temperature was 37 鈩，

本文編號：1829759