本文選題：CRISPR + Cas9�。� 參考：《華東師范大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：單基因遺傳病是因?yàn)轶w內(nèi)一個(gè)基因發(fā)生功能性突變而導(dǎo)致的。超過(guò)3000種人類(lèi)疾病與單個(gè)基因突變相關(guān)。迄今為止,藥物仍然無(wú)法根治單基因遺傳病,基因治療成為治療單基因遺傳病的最佳手段。傳統(tǒng)的基因治療手段依賴病毒載體向體內(nèi)傳遞外源基因,從而替代體內(nèi)有缺陷的基因行使功能,但是這一方法存在諸多缺點(diǎn)。近年來(lái)興起的CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)因其操作簡(jiǎn)便、基因定點(diǎn)修飾效率高等特點(diǎn),在基因治療方面顯示出巨大潛力。CRISPR-Cas9技術(shù)的作用原理是在向?qū)NA引導(dǎo)下,由Cas9核酸酶識(shí)別基因組特異位點(diǎn)并對(duì)其進(jìn)行切割的過(guò)程。由于CRISPR-Cas9技術(shù)操作簡(jiǎn)便,效率高,已超越ZFNs與TALLEN成為基因編輯的首要工具,目前已被廣泛應(yīng)用于腫瘤、免疫、農(nóng)作物等研究。CRISPR-Cas9技術(shù)發(fā)展的下一個(gè)目標(biāo)將是能廣泛在個(gè)體體內(nèi)清除或修復(fù)各種遺傳病致病基因的突變,從而達(dá)到緩解疾病病癥的目的。B型血友病是基因治療的理想模型,為此我們開(kāi)展了CRISPR-Cas9技術(shù)在治療單基因遺傳病B型血友病的應(yīng)用研究。我們首先根據(jù)B型血友病家系中發(fā)現(xiàn)的F9基因的新型突變(第371位酪氨酸突變?yōu)樘於彼?設(shè)計(jì)模擬該突變的血友病小鼠模型。發(fā)現(xiàn)人源F9基因的第371位酪氨酸位點(diǎn)在各物種間是高度同源的,在小鼠體內(nèi)該位點(diǎn)位于F9基因的第381位氨基酸。通過(guò)向小鼠的一細(xì)胞期胚胎注射Cas9 mRNA,sgRNA與ssODN,成功構(gòu)建了模擬病人新突變的點(diǎn)突變小鼠F9Y381D。同時(shí)還構(gòu)建了模擬病人該位點(diǎn)已報(bào)導(dǎo)的F9Y381S突變小鼠,與第383位氨基酸突變?yōu)榻K止密碼子的敲除小鼠F9Y38STOP。通過(guò)對(duì)F9Y38ID突變小鼠及另外兩種突變小鼠進(jìn)行活化凝血酶原時(shí)間與尾部凝血實(shí)驗(yàn)的測(cè)定,我們確定病人來(lái)源的F9基因的Y371D新型突變比已報(bào)導(dǎo)的Y371S突變具有更強(qiáng)的致病性。接著,我們利用構(gòu)建好的血友病小鼠模型進(jìn)行基因治療的研究。通過(guò)流體動(dòng)力學(xué)的注射方法向成體小鼠尾靜脈注射用于表達(dá)Cas9蛋白與sgRNA的質(zhì)粒,及用于同源重組的DNA(雙鏈或單鏈)模板,以期修復(fù)肝臟細(xì)胞中F9基因的Y381D突變。發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)注射治療后的FqY38ID小鼠的活化凝血酶原時(shí)間縮短,尾部凝血實(shí)驗(yàn)的存活率提高,而且注射質(zhì)粒并沒(méi)有引起肝臟內(nèi)的免疫反應(yīng)。經(jīng)過(guò)對(duì)肝臟細(xì)胞的測(cè)序分析,發(fā)現(xiàn)肝臟細(xì)胞內(nèi)單鏈模板組有0.56%(或雙鏈模板組有1.55%)的F9等位基因被修復(fù),提示只要修復(fù)肝臟細(xì)胞內(nèi)0.56%的F9基因即可緩解B型血友病的病情。為了提高肝臟細(xì)胞的基因修復(fù)率,我們引入感染能力更強(qiáng)的腺病毒載體。在向成體小鼠尾靜脈注射表達(dá)Cas9蛋白,sgRNA及攜帶同源重組模板的腺病毒后,我們發(fā)現(xiàn)雖然腺病毒系統(tǒng)在肝臟細(xì)胞內(nèi)修復(fù)了5.5%的F9基因,然而卻沒(méi)有縮短F9Y38ID小鼠的活化凝血酶原時(shí)間。通過(guò)對(duì)肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶、炎癥因子的檢測(cè)、及肝臟細(xì)胞形態(tài)的觀察,我們發(fā)現(xiàn)腺病毒系統(tǒng)會(huì)引起肝臟內(nèi)劇烈的免疫反應(yīng),可能是導(dǎo)致腺病毒治療無(wú)效果的原因。綜上所述,我們的研究表明通過(guò)Cas9基因編輯技術(shù)原位修復(fù)F9基因突變治療B型血友病的可行性,也為基因編輯技術(shù)應(yīng)用于單基因遺傳病的治療提供了有力的實(shí)驗(yàn)支持。
[Abstract]:In recent years , the gene therapy has been widely used in the research of gene therapy . It has been widely used in the research of gene therapy .

【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R554.1;R-332

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本文編號(hào)：1807468