發(fā)布時(shí)間：2018-04-14 06:39

  本文選題：微小RNA + 間充質(zhì)干細(xì)胞�。� 參考：《天津醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的:MicroRNAs(miRNAs)是一類長(zhǎng)約22nt的內(nèi)源性非編碼RNA,通過與靶基因mRNA完全或部分配對(duì)而降解靶基因mRNA或抑制其翻譯,從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá),參與細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、新陳代謝和癌癥等一系列生物學(xué)過程。許多研究表明miRNAs在間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells,MSCs)成脂/成骨分化的過程中有重要調(diào)節(jié)作用。本研究主要探討miR-196b-5p對(duì)脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化的影響,并初步探討其作用機(jī)制。方法:1、利用qRT-PCR檢測(cè)小鼠BMSCs和骨髓基質(zhì)細(xì)胞系ST2向脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化過程中miR-196b-5p表達(dá)量的變化。2、構(gòu)建miR-196b-5p過表達(dá)慢病毒質(zhì)粒miR-196b-5pLV和抑制性慢病毒質(zhì)粒miR-196b-5pspong,并用293T細(xì)胞包裝慢病毒顆粒。3、用miR-196b-5p過表達(dá)和抑制性慢病毒感染小鼠BMSCs和ST2后進(jìn)行成脂誘導(dǎo),利用qRT-PCR、WesternBlotting、油紅O染色等技術(shù)檢測(cè)miR-196b-5p對(duì)成脂分化的影響;進(jìn)行成骨誘導(dǎo),利用qRT-PCR、WesternBlotting和ALP染色等技術(shù)檢測(cè)miR-196b-5p對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響。4、利用靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)miR-196b-5p的靶基因,構(gòu)建靶基因Tgfbr1-3′UTR熒光素酶報(bào)告基因載體,利用雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)鑒定靶基因;ST2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-196b-5pmimics和miR-196b-5pinhibitor后檢測(cè)蛋白TGFBR1的表達(dá)量;miR-196b-5pmimics與Tgfbr1共轉(zhuǎn)進(jìn)行細(xì)胞拯救實(shí)驗(yàn)。5、采用4周齡雄性C57BL/6J小鼠,高脂飼料喂養(yǎng)構(gòu)建小鼠肥胖模型,同時(shí)尾靜脈注射miR-196b-5psponge慢病毒及其陰性對(duì)照病毒,造模過程中記錄各組小鼠體重,造模成功后稱量腹股溝脂肪和附睪脂肪重量,qRT-PCR檢測(cè)附睪脂肪成脂分化相關(guān)特異性基因mRNA表達(dá)變化,檢測(cè)血清中葡萄糖、胰島素、甘油三酯、游離脂肪酸水平,以此確定miR-196b-5psponge慢病毒對(duì)肥胖的影響。結(jié)果:1、miR-196b-5p在小鼠BMSCs和骨髓基質(zhì)細(xì)胞系ST2成脂誘導(dǎo)后表達(dá)量上升,成骨誘導(dǎo)后表達(dá)量下降。2、成功構(gòu)建了miR-196b-5p過表達(dá)慢病毒質(zhì)粒miR-196b-5pLV和抑制性慢病毒質(zhì)粒miR-196b-5psponge。3、用miR-196b-5pLV感染小鼠BMSCs和ST2細(xì)胞并進(jìn)行成脂誘導(dǎo)后,油紅O染色顯示過表達(dá)miR-196b-5p能促進(jìn)其分化為成熟脂肪細(xì)胞,qRT-PCR和WesternBlotting結(jié)果顯示成脂相關(guān)特異性基因PPARγ、C/EBPα、aP2和adipsin的表達(dá)均上調(diào),相反,miR-196b-5psponge感染小鼠BMSCs和ST2細(xì)胞會(huì)抑制其向脂肪細(xì)胞分化;miR-196b-5pLV感染小鼠BMSCs和ST2細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)后,ALP染色減弱,顯示miR-196b-5p抑制細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化,qRT-PCR和WesternBlotting結(jié)果顯示成骨分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Osterix、Runx2、成骨細(xì)胞表征因子堿性磷酸酶(Alkalinephosphatase,ALP)、Osteocalcin(Oc)和骨涎蛋白(BoneSialoprotein,Bsp)的表達(dá)下調(diào),相反,miR-196b-5psponge感染小鼠BMSCs和ST2細(xì)胞會(huì)促進(jìn)其成骨分化。4、miR-196b-5pmimics和Tgfbr1-3′UTR共轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞后熒光素酶活性顯著下;轉(zhuǎn)染miR-196b-5pmimics后蛋白TGFBR1的表達(dá)量下降,轉(zhuǎn)染miR-196b-5pinhibitor后蛋白TGFBR1的表達(dá)量上調(diào);miR-196b-5pmimics能拯救Tgfbr1對(duì)ST2細(xì)胞的抑制成脂分化作用。5、飼喂高脂飼料組小鼠較飼喂普通飼料組小鼠體重明顯上升,造模成功,高脂飼料喂養(yǎng)同時(shí)尾靜脈注射miR-196b-5psponge慢病毒組體重較高脂模型組體重下降,腹股溝脂肪和附睪脂肪重量減輕,qRT-PCR檢測(cè)附睪脂肪成脂相關(guān)特異性基因PPARγ,C/EBPα,aP2和adipsin的表達(dá)水平均低于高脂模型組,血清中葡萄糖、胰島素、游離脂肪酸和甘油三酯水平也下降。結(jié)論:1、miR-196b-5p在小鼠BMSCs和ST2細(xì)胞成脂分化過程中表達(dá)量上調(diào),而在成骨分化過程中表達(dá)量下調(diào)。2、miR-196b-5pLV慢病毒能促進(jìn)小鼠BMSCs和ST2細(xì)胞成脂分化,抑制其成骨分化;而miR-196b-5psponge慢病毒能抑制小鼠BMSCs和ST2細(xì)胞成脂分化,促進(jìn)其成骨分化。3、miR-196b-5p可能通過靶向抑制Tgfbr1的表達(dá)來促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化。4、miR-196b-5psponge慢病毒能緩解小鼠血清中高脂飲食導(dǎo)致的生化指標(biāo)紊亂,提高胰島素敏感性,抑制脂肪細(xì)胞體積增大,抑制肥胖的產(chǎn)生。
[Abstract]:Objective : To investigate the effects of miR - 196b - 5p on the differentiation of osteoblast and osteoblast by means of qRT - PCR , Western Blotting and ALP staining . The results showed that miR - 196b - 5pacts inhibited the differentiation of bone marrow cells into adipogenic cells .

【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R3416

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 寧小敏;李國喜;楊公社;;miR-196a-1在3T3-L1脂肪細(xì)胞分化中的表達(dá)及作用[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào);2011年01期

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本文編號(hào)：1748169