本文選題：輪狀病毒 + microRNAs��； 參考：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2017年博士論文

【摘要】：宿主細(xì)胞與病毒的相互作用研究對揭示病毒的復(fù)制機(jī)制具有重要意義。在病毒感染過程中,病毒能夠編碼microRNA分子調(diào)控自身基因及宿主基因的表達(dá),促進(jìn)病毒的復(fù)制及逃避宿主的免疫監(jiān)控。研究表明,在病毒感染過程中,病毒能夠劫持宿主細(xì)胞的自噬膜系統(tǒng)來實現(xiàn)病毒自身的復(fù)制。在這個過程中有多個調(diào)控環(huán)節(jié)和因素參與,但劫持的具體機(jī)制還不清楚,尚需探討。輪狀病毒(Rotavirus,RV)是一種基因組分節(jié)段的雙鏈RNA病毒,為呼腸病毒科,輪狀病毒屬,在引起嬰幼兒腹瀉中有重要的病原學(xué)及流行病學(xué)地位。論文圍繞RV復(fù)制的機(jī)制,特別是對感染宿主細(xì)胞后的細(xì)胞自噬調(diào)控機(jī)理以及對病毒復(fù)制能力的相互關(guān)系進(jìn)行了深入細(xì)致的研究。這項研究不僅對揭示病毒復(fù)制的分子機(jī)制、對致病機(jī)理探討以及藥物靶點篩選均有重要意義。在這項研究中我們采用了小RNA深度測序的方法,對從流行區(qū)分離的野毒株ZTR68(G1P[8]型)感染宿主細(xì)胞MA104(猴腎傳代細(xì)胞系)后所產(chǎn)生的差異表達(dá)miRNAs進(jìn)行了篩選,發(fā)現(xiàn)其中小RNA分子chr-1755表達(dá)明顯高于其他,因此推測該分子可能在RV復(fù)制中發(fā)揮主要作用,將其命名為vsRNA1755。為了證實該分子在不同病毒型和不同細(xì)胞中是否存在表達(dá)普遍性,實驗選用了另外4個不同G型(G2、G3、G4、G9)的RV和兩種細(xì)胞HT-29(人結(jié)腸癌細(xì)胞系)、Caco-2(人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞系)進(jìn)行了對比,發(fā)現(xiàn)vsRNA1755均有高表達(dá)。隨后對G1型ZTR68毒株感染MA104細(xì)胞后的一系列調(diào)控機(jī)制做了深入研究。在病毒早期復(fù)制能力與vsRNA1755關(guān)系中發(fā)現(xiàn)二者呈正相關(guān)性。通過BLAST比對及體外轉(zhuǎn)染NSP4基因分析表明,vsRNA1755來源于RV的非結(jié)構(gòu)蛋白NSP4(編碼腸毒素與病毒RNA復(fù)制相關(guān)基因)基因,是由NSP4基因coil-coiled區(qū)域編碼的小RNA分子,生物合成中由Dicer-1和AGO1參與。為了尋找vsRNA1755的下游靶基因,通過miRanda軟件預(yù)測,揭示胰島素樣生長因子 1 受體(Insulin-like Growth Factor 1 Receptor,IGF1R)是 vsRNA1755 可能靶點。我們用雙熒光素酶報告系統(tǒng),經(jīng)體外轉(zhuǎn)染vsRNA1755模擬物(mimics)轉(zhuǎn)染細(xì)胞檢測表達(dá)情況,證明二者存在靶定關(guān)系,vsRNA1755能夠下調(diào)IGF1R的表達(dá)。在獲得了靶基因關(guān)系后,我們對vsRNA1755的生物學(xué)功能進(jìn)行了探討,考慮到IGF1R是PI3K/Akt通路的起始元件且與自噬通路的激活密切相關(guān),我們的實驗集中在vsRNA1755與自噬發(fā)生的機(jī)理研究上。通過自噬流檢測試劑盒(特異性檢測)及電鏡形態(tài)學(xué)檢測發(fā)現(xiàn),當(dāng)轉(zhuǎn)染了自噬標(biāo)志物L(fēng)C3蛋白再感染RV后,LC3-I轉(zhuǎn)換為LC3-II,說明RV感染后的細(xì)胞發(fā)生了明確的自噬現(xiàn)象。共轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白(EGFP)與LC3的示蹤結(jié)果顯示,RV與LC3存在共定位關(guān)系,進(jìn)一步驗證RV感染與自噬有密切關(guān)系。形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),感染后出現(xiàn)自噬小體,感染4小時明顯增多,后期則可見形成的病毒池變大,病毒顆粒數(shù)增加。當(dāng)用自噬抑制劑3-MA后,病毒復(fù)制能力下降,提示自噬促進(jìn)了病毒復(fù)制。在研究vsRNA1755與自噬調(diào)控機(jī)制實驗中,我們用該分子的模擬物(mimics)轉(zhuǎn)染細(xì)胞檢測了多個自噬調(diào)控蛋白(ATG5、ATG12、P62)的表達(dá),發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)蛋白ATG5和ATG12表達(dá)上調(diào),自噬底物P62表達(dá)下調(diào)。蛋白印跡實驗顯示,過表達(dá)vsRNA1755后,自噬特異性底物P62蛋白明顯下調(diào)。通過加入PI3K/Akt通路抑制劑LY294002,檢測病毒的感染及拷貝數(shù),結(jié)果顯示,PI3K/Akt通路對病毒的復(fù)制起抑制作用。對vsRNA1755與靶基因IGF1R進(jìn)行的qRT-PCR和蛋白印跡檢測,結(jié)果提示,RV在感染早期可以下調(diào)IGF1R的表達(dá),推測vsRNA1755通過下調(diào)IGF1R抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路的活化,激活了自噬,促進(jìn)病毒復(fù)制。體外轉(zhuǎn)染mimics活化上調(diào)了該通路的結(jié)果也印證了這一可能性。綜上所述,RV感染宿主細(xì)胞后,由RV的NSP4基因編碼的小RNA分子1755(vsRNA1755),通過抑制IGF1R表達(dá)引起下游PI3K/Akt/mTOR信號通路失活,解除對細(xì)胞自噬通路的抑制,激活細(xì)胞自噬,病毒劫持了細(xì)胞的自噬通路促進(jìn)了自身的復(fù)制。研究的結(jié)果不僅為揭示RV感染機(jī)制提供了主要依據(jù),也為病毒與宿主細(xì)胞間的相互作用及未來有針對性、更加精準(zhǔn)的設(shè)計藥物靶點提供了有意義的理論依據(jù)。
[Abstract]:It is important to study the interaction between host cell and virus replication mechanism to reveal the virus. During viral infection, the virus can express microRNA encoding gene and its molecular regulation of host genes to promote viral replication and evade the host immune surveillance. The results show that during viral infection, the virus can hijack host cell the autophagic membrane system to achieve viral replication. In many regulatory factors in this process, but the specific mechanism of hijacking is not clear, still need further discussion. Rotavirus (Rotavirus, RV) is a double stranded RNA virus genome segment, to Reoviridae, rotavirus in the virus, caused by an important etiology and epidemiology of diarrhea in infants. The status of the mechanism of RV replication, especially on the regulation mechanism of autophagy after infecting the host cells and the virus The relationship between the replication capacity of in-depth and meticulous research. This research is not only to reveal the molecular mechanism of virus replication, screening has important significance to study the pathogenic mechanism and drug targets. In this study we adopted the method of small RNA deep sequencing, the wild strain ZTR68 isolated from endemic areas (G1P[8] (MA104) host cells infected monkey kidney cell line miRNAs) were differentially expressed after the discovery, the small molecules of RNA chr-1755 expression was significantly higher than the other, so that the molecule may play a major role in the replication of RV, named vsRNA1755., in order to confirm whether the molecular expression of universality in different virus and in the different cell lines were selected in 4 different type G (G2, G3, G4, G9) RV and two cells HT-29 (human colon cancer cell line), Caco-2 (human colorectal adenocarcinoma cell line) were By contrast, found that high vsRNA1755 expression. Then a series of regulatory mechanism of MA104 cells infected with G1 ZTR68 strain after done in-depth research. In early stage of viral replication found the relationship between the two positive ability and vsRNA1755 relationship. By comparing BLAST and NSP4 gene transfection in vitro analysis showed that the source of vsRNA1755 non structural protein in RV NSP4 (encoding enterotoxin and viral RNA replication related gene) gene, is composed of small molecular RNA NSP4 gene coil-coiled region encoding, participate in the biosynthesis of AGO1 by Dicer-1 and vsRNA1755. In order to find the downstream target genes, predicted by miRanda, revealing the insulin-like growth factor 1 receptor (Insulin-like Growth Factor 1 Receptor, IGF1R) is vsRNA1755 target. We used dual luciferase reporter system, after in vitro transfection of vsRNA1755 mimics (mimics) transfected cells to detect expression, certificate two There are targeted, vsRNA1755 can downregulate the expression of IGF1R. The target gene was obtained after our relationship, the biological functions of vsRNA1755 are discussed, considering that IGF1R is the starting element of PI3K/Akt pathway activation and autophagy pathway is closely related to our experimental research focusing on the mechanism of vsRNA1755 and autophagy detection reagent. Flow through the box (autophagy specific detection) detection and morphology, when transfected with autophagy marker protein LC3 re infection after RV, LC3-I converted to LC3-II, which indicated the phenomenon of autophagy specific RV infected cells. Co transfection of green fluorescent protein (EGFP) displays the results with LC3 tracer, and RV LC3 is Co located, to further verify the close relationship between RV infection and autophagy. The morphological observation of autophagosomes appeared 4 hours after infection, infection increased significantly, the latter form of the virus pool become visible Large number of virus particles increased. When the autophagy inhibitor 3-MA, decreased viral replication capacity, promote viral replication. Suggest that autophagy and autophagy regulation mechanism in vsRNA1755 experiment, we use the analogue of the molecule (mimics) transfected cells multiple protein autophagy regulation (ATG5, ATG12, P62). The expression was up-regulated the expression of autophagy related protein ATG5 and ATG12, down regulate the expression of autophagy substrates of P62. Western blot results showed that overexpression of vsRNA1755, autophagy specific substrates of P62 protein decreased obviously by adding PI3K/Akt inhibitor LY294002, detection of virus infection and copy number, results showed that the replication of the PI3K/Akt pathway on virus inhibition the results suggest that. QRT-PCR and Western blotting detection of vsRNA1755 and target gene IGF1R, RV expression in the early stage of infection can be reduced IGF1R, suggesting that vsRNA1755 inhibits PI3K/Akt/ through down-regulation of IGF1R The activation of mTOR signaling pathway, activation of autophagy, promote viral replication in vitro transfection. Mimics activation of this pathway results raised also confirms this possibility. In conclusion, RV infection of host cells by small molecule NSP4, RNA gene encoding RV 1755 (vsRNA1755), through inhibiting IGF1R expression induced by PI3K/Akt/mTOR signaling pathway inactivation of disinhibition on autophagy pathway, activation of autophagy, virus hijacks the autophagy pathway cells promoted their replication. The results of the study not only provides the main basis for revealing the mechanism of RV infection, as well as the interaction between virus and host cells and future targeted, provides a theoretical basis for meaningful the design of drug targets more accurately.

【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R373

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本文編號：1748076