發(fā)布時間：2018-03-29 15:08

  本文選題：Kringle　切入點：5　出處：《西北大學》2016年博士論文

【摘要】：Kringle 5是纖溶酶原的第五個片段,分子量約8KD,是Cao等于1977年通過蛋白酶消化人纖溶酶原和分子克隆的方法得到的。Kringle 5主要作用于血管內(nèi)皮細胞,使血管內(nèi)皮細胞生長周期停滯而導致血管內(nèi)皮細胞凋亡,Kringle 5還能抑制血管內(nèi)皮細胞的遷移。但Kringle 5對于其它細胞,如成纖維細胞、人干細胞等沒有作用。雖然Kringle 5具有抑制血管內(nèi)皮細胞增殖和分化的作用,對于治療腫瘤具有重要的意義,但Kringle 5的作用靶點是什么?它是如何導致血管內(nèi)皮細胞凋亡的?等等問題,到目前為止,還沒有明確的答案。針對這種情況,本研究以原核表達的Kringle 5為靶蛋白篩選Kringle 5在體內(nèi)的結(jié)合蛋白,并通過SPR和前沿色譜法確認了VDAC-1與Kringle 5的結(jié)合和相互作用。我們試圖建立一種通過噬菌體肽庫技術(shù)結(jié)合分子對接技術(shù)和SPR技術(shù)篩選蛋白體內(nèi)結(jié)合蛋白的快速篩選系統(tǒng),為Kringle 5體內(nèi)結(jié)合蛋白的篩選和研究其抑制血管內(nèi)皮細胞生長機理奠定基礎(chǔ)。本研究主要取得了以下成果：(1) 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中人Kringle 5蛋白的基因序列設(shè)計引物擴增出Kringle 5基因,將其成功表達在pET28b原核表達載體中,并在BL21細胞中誘導表達。SDS-PAGE蛋白電泳分析發(fā)現(xiàn),帶有His標簽的Kringle 5蛋白出現(xiàn)在破碎細胞上清液中。上清液經(jīng)鎳親和柱分離后,得到純度約為86%的重組Kringle 5蛋白。(2)以Kringle 5蛋白為靶蛋白,對噬菌體環(huán)7肽庫進行篩選。4輪篩選后,噬菌體回收率從6.25×10~(-9)提高到了1.57×10~(-7),噬菌體得到富集。挑取噬菌體單克隆測序后發(fā)現(xiàn),隨機挑取的50個單克隆分別表達13個短肽,ELASA分析這13個短肽與Kringle5的親和力,最終確定IGNSNTL為Kringle 5的高親和短肽。以該短肽比對NCBI人源蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫,共找到103種與該短肽同源性較高的蛋白。逐一比對分析這103種蛋白的氨基酸序列及功能,發(fā)現(xiàn)這些蛋白歸屬于28類。根據(jù)這28類蛋白的功能、作用以及它們在細胞內(nèi)的作用途徑和作用方式,初步認確定Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor等9種蛋白可能是Kringle 5蛋白的體內(nèi)結(jié)合蛋白。根據(jù)Kringle 5在人體內(nèi)的作用方式和作用途徑推斷,VDAC-1、Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor和ABCA12可能為Kringle 5蛋白的體內(nèi)結(jié)合蛋白。(3)同源建模和直接建模的方式構(gòu)建了Kringle 5及初步篩選的9種蛋白的晶體結(jié)構(gòu)。HEX軟件分析了Kringle 5蛋白與這9種蛋白的作用,分子對接結(jié)果發(fā)現(xiàn)Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor、VDAC-1和Protein C-ets-2與Kringle 5具有相對較低的結(jié)合自由能,其結(jié)合自由能分別為-837.55 J/mol、-822.65 J/mol和-832.6 J/mol.蛋白活性位點分析發(fā)現(xiàn),Kringle 5與Protein C-ets-2作用時并沒有進入它形成的活性口袋,但進入了Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor、VDAC-1、ABCA12和Endothelin B receptor isoform X2形成的活性口袋中。分析Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor、 VDAC-1、ABCA12和Endothelin B receptor isoform X2蛋白活性中心參與與Kringle 5作用的氨基酸,Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor、VDAC-1和ABCA12活性中心參與對接的氨基酸多數(shù)出現(xiàn)在IGNSNTL篩選短肽中,說明IGNSNTL短肽較好地模擬了Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor、VDAC-1和ABCA12蛋白的活性中心。根據(jù)化學反應(yīng)能量最低原則和化學反應(yīng)空間匹配原則,推斷Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor和VDAC-1蛋白為Kringle 5蛋白的結(jié)合蛋白。(4)為了證明噬菌體展示技術(shù)篩選的9種蛋白能否與Kringle 5作用,明確分子對接技術(shù)在結(jié)合蛋白篩選中的作用,本部分構(gòu)建了Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor、VDAC-1和ABCA12等9種蛋白的原核表達載體,經(jīng)誘導表達后,利用SPR技術(shù)分析了Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor、VDAC-1和ABCA12等9種蛋白與Kringle 5蛋白的相互作用。SPR分析表明,除了VDAC-1蛋白,Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor和ABCA12等8種蛋白均不能與Kringle 5發(fā)生作用,表明VDAC-1是Kringle 5蛋白的體內(nèi)結(jié)合蛋白。(5)根據(jù)NCBI中VDAC-1的基因序列,以pCMV6-XL5-VDAC-1為模版克隆了VDAC-1基因,構(gòu)建了VDAC-1蛋白的原核表達載體pET28b-VDAC-1,并在BL21細胞中誘導表達成功。SDS-PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn)VDAC-1蛋白以包涵體的形式表達。經(jīng)變性復(fù)性后分離和柱上復(fù)性分離兩種分離方法的分離后,變性復(fù)性后分離的分離方法蛋白產(chǎn)率高于柱上復(fù)性分離方法蛋白的產(chǎn)率。研究VDAC-1蛋白復(fù)性條件發(fā)現(xiàn),當復(fù)性條件為溶液pH值8.0、氧化型谷胱甘肽濃度0.2 mmol/L、還原型谷胱甘肽的濃度1 mmol/L時VDAC-1蛋白的復(fù)性產(chǎn)率最高,蛋白產(chǎn)率可達55.6%。(6)優(yōu)化Kringle 5在CM5芯片上的固定條件后,以該優(yōu)化條件固定Kringle 5于CM芯片上,分析了VDAC-1與Kringle 5相互作用的熱力學參數(shù),結(jié)果表明,VDAC-1與Kringle 5的結(jié)合常數(shù)為2.43×e3 L/mol、解離常數(shù)為4.12×e-4L/mol。前沿色譜法進一步分析了Kringle 5與VDAC-1的相互作用,結(jié)果表明VDAC-1能與固定化的Kringle 5發(fā)生相互作用,其結(jié)合常數(shù)為23.54 L/mol,解離常數(shù)為0.097 L/mol。因此VDAC-1為Kringle 5的體內(nèi)結(jié)合蛋白。本研究通過噬菌體展示肽庫技術(shù)結(jié)合分子模擬對接技術(shù)篩選Kringle 5的體內(nèi)結(jié)合蛋白,SPR證明該法能有效縮小Kringle 5結(jié)合蛋白的篩選范圍,通過該法篩選的Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor、VDAC-1和ABCA12蛋白中的VDAC-1蛋白經(jīng)SPR與前沿色譜證明能與Kringle 5發(fā)生作用。因此以噬菌體展示肽庫技術(shù)為基礎(chǔ)結(jié)合分子模擬對接技術(shù)和SPR技術(shù)篩選靶蛋白體內(nèi)結(jié)合蛋白的方法是有效和可行的。
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【學位授予單位】：西北大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R363

【參考文獻】

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本文編號：1681662