本文選題：丙型肝炎病毒　切入點：疫苗　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的:丙型肝炎病毒(HCV)是全球性傳染性疾病病原體,慢性感染可能引起肝炎、肝纖維化、肝硬化乃至肝癌。傳統(tǒng)治療方法利巴韋林與干擾素聯(lián)用毒副作用較大,且持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答率(Sustained virological response,SVR)較低,只有50%-60%。目前已經(jīng)上市的直接抗病毒藥物(Direct acting antiviral agents,DAAs)在某些地區(qū)持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答率高達(dá)90%以上。然而DAAs治療存在以下缺點:藥物在疾病晚期不能逆轉(zhuǎn)惡性化進(jìn)展;DAAs藥物價格昂貴,患者常無力負(fù)擔(dān);DAAs對于某些亞型HCV感染治療效果較差;藥物的使用不能防止新發(fā)感染;病毒易出現(xiàn)耐藥性變異。接受DAAs治療的患者,若是目前或曾經(jīng)感染過HBV,再次感染還會導(dǎo)致嚴(yán)重肝損傷甚至死亡。因此,HCV疫苗的制備對于疾病的防治非常重要。當(dāng)前研究中HCV疫苗種類有:重組蛋白疫苗、多肽疫苗、DNA疫苗、病毒載體疫苗等。有多個疫苗進(jìn)入了 Ⅰ/Ⅱ臨床試驗,DNA疫苗ChronVac-C、腺病毒載體疫苗Ad6-NS、ChAd3-NS等不僅可以在健康人體內(nèi)誘發(fā)有效的體液免疫反應(yīng),還可以在慢性感染的患者體內(nèi)提高干擾素加利巴韋林的持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答率。HCV疫苗制備的主要障礙是基因序列的高度異質(zhì)性,因此在一定的地域,應(yīng)該根據(jù)該地區(qū)流行的HCV基因型序列片段。腺病毒載體疫苗以其安全有效、持續(xù)時間長、激發(fā)免疫反應(yīng)強(qiáng)等特點成為疫苗研發(fā)較好的選擇。特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)對于HCV的清除起到?jīng)Q定性的作用。因此,我們選取能激發(fā)顯著細(xì)胞免疫的1b型HCVNS3-5Bmut片段,構(gòu)建候選疫苗AdNSmut,并初步在小鼠上對NS3-5Bmut片段進(jìn)行免疫原性評價,以期為后續(xù)HCV候選疫苗的臨床前評價提供可供選擇的免疫原和接種方案。方法:PCR從1b型HCV基因中擴(kuò)增獲得NS3-NS5B片段,定點突變NS5B基因使RNA聚合酶失去活性,獲得NS3-NS5Bmut片段。將該目的片段連接入腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC315中,Western blot和免疫熒光鑒定該質(zhì)粒外源基因NS3,NS5B蛋白的表達(dá)。重組穿梭質(zhì)粒pDC315-NS3-5Bmut(縮寫為pDC315-NSmut)與腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞,獲得復(fù)制缺陷型重組腺病毒AdNSmut,PCR檢測外源基因完整性,RT-PCR檢測mRNA轉(zhuǎn)錄情況,Western blot與質(zhì)譜檢測病毒感染細(xì)胞NS3-NS5B蛋白的表達(dá)。大量擴(kuò)增并純化AdNSmut腺病毒,測定病毒滴度。選擇C57BL/6小鼠作為動物模型,分為接種緩沖液的安慰劑組、接種AdEGFP的陰性對照組、接種AdNSmut的實驗組。不同病毒注射組分別肌肉注射 108PFU、109PFU、1010PFU、1011PFU 的 AdEGFP 或 AdNSmut,經(jīng)過初次免疫3周,加強(qiáng)免疫2周后分離小鼠脾臟淋巴細(xì)胞,Elispot和流式胞內(nèi)染色檢測細(xì)胞免疫反應(yīng),眼球取血檢測體液免疫反應(yīng)。結(jié)果:PCR擴(kuò)增獲得HCV 1b NS3-5Bmut序列,成功構(gòu)建pDC315-NSmut穿梭質(zhì)粒,免疫熒光和Western blot證實該質(zhì)粒能表達(dá)正確的NS3 NS5B外源蛋白。重組穿梭質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞,包裝產(chǎn)生了具有感染性且表達(dá)外源基因的復(fù)制缺陷型重組腺病毒AdNSmut。純化后獲得滴度為2.74×1013PFU/ml的高純度高滴度病毒,用于免疫接種C57BL/6小鼠,免疫后檢測到接種AdNSmut的小鼠有顯著的HCV特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。結(jié)論:本研究成功構(gòu)建了能夠表達(dá)1b型HCV非結(jié)構(gòu)蛋白NS3-5Bmut的復(fù)制缺陷型重組腺病毒AdNSmut。該重組腺病毒能夠?qū)崿F(xiàn)快速、大量、高純度制備,能夠在C57BL/6小鼠體內(nèi)誘發(fā)顯著地細(xì)胞免疫反應(yīng),安全有效,證明NS3-5Bmut片段有望作為HCV候選疫苗的免疫原,同時也為HCV腺病毒疫苗動物實驗病毒接種滴度和免疫方案提供了參考。
[Abstract]:Hepatitis C virus ( HCV ) is a worldwide infectious disease pathogen . Chronic infection may cause hepatitis , liver fibrosis , liver cirrhosis and liver cancer . The recombinant adenovirus AdNSmut was amplified and purified by RT - PCR . The recombinant adenovirus AdNSmut with high titer of 2.74 脳 1013渭g / ml was successfully constructed .

【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1682999