本文選題：丙型肝炎病毒　切入點：疫苗　出處：《南方醫(yī)科大學》2017年碩士論文

【摘要】：目的:丙型肝炎病毒(HCV)是全球性傳染性疾病病原體,慢性感染可能引起肝炎、肝纖維化、肝硬化乃至肝癌。傳統(tǒng)治療方法利巴韋林與干擾素聯(lián)用毒副作用較大,且持續(xù)病毒學應答率(Sustained virological response,SVR)較低,只有50%-60%。目前已經(jīng)上市的直接抗病毒藥物(Direct acting antiviral agents,DAAs)在某些地區(qū)持續(xù)病毒學應答率高達90%以上。然而DAAs治療存在以下缺點:藥物在疾病晚期不能逆轉惡性化進展;DAAs藥物價格昂貴,患者常無力負擔;DAAs對于某些亞型HCV感染治療效果較差;藥物的使用不能防止新發(fā)感染;病毒易出現(xiàn)耐藥性變異。接受DAAs治療的患者,若是目前或曾經(jīng)感染過HBV,再次感染還會導致嚴重肝損傷甚至死亡。因此,HCV疫苗的制備對于疾病的防治非常重要。當前研究中HCV疫苗種類有:重組蛋白疫苗、多肽疫苗、DNA疫苗、病毒載體疫苗等。有多個疫苗進入了 Ⅰ/Ⅱ臨床試驗,DNA疫苗ChronVac-C、腺病毒載體疫苗Ad6-NS、ChAd3-NS等不僅可以在健康人體內誘發(fā)有效的體液免疫反應,還可以在慢性感染的患者體內提高干擾素加利巴韋林的持續(xù)病毒學應答率。HCV疫苗制備的主要障礙是基因序列的高度異質性,因此在一定的地域,應該根據(jù)該地區(qū)流行的HCV基因型序列片段。腺病毒載體疫苗以其安全有效、持續(xù)時間長、激發(fā)免疫反應強等特點成為疫苗研發(fā)較好的選擇。特異性細胞免疫反應對于HCV的清除起到?jīng)Q定性的作用。因此,我們選取能激發(fā)顯著細胞免疫的1b型HCVNS3-5Bmut片段,構建候選疫苗AdNSmut,并初步在小鼠上對NS3-5Bmut片段進行免疫原性評價,以期為后續(xù)HCV候選疫苗的臨床前評價提供可供選擇的免疫原和接種方案。方法:PCR從1b型HCV基因中擴增獲得NS3-NS5B片段,定點突變NS5B基因使RNA聚合酶失去活性,獲得NS3-NS5Bmut片段。將該目的片段連接入腺病毒穿梭質粒pDC315中,Western blot和免疫熒光鑒定該質粒外源基因NS3,NS5B蛋白的表達。重組穿梭質粒pDC315-NS3-5Bmut(縮寫為pDC315-NSmut)與腺病毒骨架質粒共轉染293A細胞,獲得復制缺陷型重組腺病毒AdNSmut,PCR檢測外源基因完整性,RT-PCR檢測mRNA轉錄情況,Western blot與質譜檢測病毒感染細胞NS3-NS5B蛋白的表達。大量擴增并純化AdNSmut腺病毒,測定病毒滴度。選擇C57BL/6小鼠作為動物模型,分為接種緩沖液的安慰劑組、接種AdEGFP的陰性對照組、接種AdNSmut的實驗組。不同病毒注射組分別肌肉注射 108PFU、109PFU、1010PFU、1011PFU 的 AdEGFP 或 AdNSmut,經(jīng)過初次免疫3周,加強免疫2周后分離小鼠脾臟淋巴細胞,Elispot和流式胞內染色檢測細胞免疫反應,眼球取血檢測體液免疫反應。結果:PCR擴增獲得HCV 1b NS3-5Bmut序列,成功構建pDC315-NSmut穿梭質粒,免疫熒光和Western blot證實該質粒能表達正確的NS3 NS5B外源蛋白。重組穿梭質粒和骨架質粒共轉染293A細胞,包裝產(chǎn)生了具有感染性且表達外源基因的復制缺陷型重組腺病毒AdNSmut。純化后獲得滴度為2.74×1013PFU/ml的高純度高滴度病毒,用于免疫接種C57BL/6小鼠,免疫后檢測到接種AdNSmut的小鼠有顯著的HCV特異性細胞免疫反應。結論:本研究成功構建了能夠表達1b型HCV非結構蛋白NS3-5Bmut的復制缺陷型重組腺病毒AdNSmut。該重組腺病毒能夠實現(xiàn)快速、大量、高純度制備,能夠在C57BL/6小鼠體內誘發(fā)顯著地細胞免疫反應,安全有效,證明NS3-5Bmut片段有望作為HCV候選疫苗的免疫原,同時也為HCV腺病毒疫苗動物實驗病毒接種滴度和免疫方案提供了參考。
[Abstract]:Hepatitis C virus ( HCV ) is a worldwide infectious disease pathogen . Chronic infection may cause hepatitis , liver fibrosis , liver cirrhosis and liver cancer . The recombinant adenovirus AdNSmut was amplified and purified by RT - PCR . The recombinant adenovirus AdNSmut with high titer of 2.74 脳 1013渭g / ml was successfully constructed .

【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R392

【參考文獻】

相關期刊論文 前4條

1 劉菲菲;龔作炯;;丙型病毒性肝炎抗病毒治療的研究進展[J];疑難病雜志;2017年03期

2 陳紅波;張永峰;王一凡;王明松;;干擾素聯(lián)合利巴韋林治療慢性丙型肝炎的療效及不良反應觀察[J];中外醫(yī)學研究;2015年35期

3 Faezeh Ghasemi;Sina Rostami;Zahra Meshkat;;Progress in the development of vaccines for hepatitis C virus infection[J];World Journal of Gastroenterology;2015年42期

4 ;A candidate DNA vaccine elicits HCV specific humoral and cellular immune responses[J];World Journal of Gastroenterology;2004年17期

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本文編號：1682999