本文關鍵詞： 微小RNA-15b HBV復制 肝細胞核因子1α HBV增強子Ⅰ　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：乙型肝炎病毒(HBV)感染是一個全球性的公共衛(wèi)生問題。HBV感染可以引起急性或慢性肝炎,嚴重者能夠?qū)е掳l(fā)生肝硬化甚至肝癌。HBV感染宿主后,HBV共價閉合環(huán)狀DNA(HBV ccc DNA)可整合入宿主細胞的染色體中,并能夠在宿主細胞中復制,可形成慢性持續(xù)性感染狀態(tài)。對于HBV的治療,雖然臨床上應用干擾素α和核苷類似物治療HBV感染,能夠一定程度上抑制病毒復制,但是由于病毒突變和HBV ccc DNA的存在,這些藥物不能產(chǎn)生持續(xù)的抗病毒免疫應答,不能夠徹底清除肝細胞內(nèi)的乙肝病毒。抑制宿主體內(nèi)HBV病毒復制,降低其致病性,需要深入分析HBV-宿主的之間的相互作用,研究病毒復制調(diào)控的機制。近年來的研究表明,micro RNA(miRNA)是病毒與宿主相互作用的一類新的調(diào)控分子,在病毒的復制及致病中發(fā)揮重要的作用。深入研究miRNA在HBV復制及致病中的作用,有利于進一步闡明HBV與宿主的相互作用,并為發(fā)展新型的抗HBV藥物提供新的靶點和策略。為了探索HBV復制相關的miRNA,我們首先利用不同HBV復制表達水平的細胞系,通過生物芯片分析,篩選可能與HBV復制相關的miRNA。然后通過研究miRNA與HBV復制之間的相互關系及分子機制,闡明miRNA在HBV-宿主相互關系中的作用。1.miR-15b對HBV復制與表達的影響研究(1)HBV復制相關miRNA的篩選及鑒定為了探索HBV復制相關的miRNA,我們用Hep G2細胞系、Hep G2.2.15細胞系、Hep Ad38細胞系分別作為無HBV復制細胞模型、HBV低復制細胞模型、HBV高復制細胞模型,通過miRNA生物芯片分析這三種細胞系中miRNA表達水平的變化,選擇6個隨病毒復制表達增加而逐漸降低的miRNA,作為可能與HBV復制相關的候選miRNA。然后將miRNA模擬物轉(zhuǎn)染入瞬時表達HBV的細胞中,通過檢測HBe Ag表達水平的變化,篩選HBV復制相關的miRNA,結(jié)果表明:僅有miR-15b能夠促進HBe Ag的表達,其他miRNA對HBe Ag表達無顯著影響。因此我們選擇miR-15b作為研究對象,研究其在HBV復制中的作用及分子機制。(2)miR-15b對HBV復制與表達的影響我們通過在胞外分泌的HBe Ag、HBs Ag、HBV DNA以及胞內(nèi)HBV RNA、HBV復制中間體等水平檢測miR-15b對HBV復制及蛋白表達的影響。在HBV瞬時表達的Huh7細胞以及HBV穩(wěn)定表達的Hep G2.2.15細胞中,miR-15b過表達能夠促進HBV的復制與表達;抑制內(nèi)源性miR-15b的表達能夠降低HBV的復制與表達。為了在體內(nèi)水平檢測miR-15b對HBV復制的影響,我們使用重組8型腺相關病毒載體介導的乙型肝炎病毒持續(xù)感染小鼠模型,通過高壓水動力法將miR-15b抑制性載體注射入小鼠體內(nèi),檢測HBV DNA,結(jié)果顯示:抑制內(nèi)源性miR-15b的表達后小鼠血清中HBV DNA拷貝數(shù)降低。上述結(jié)果說明:miR-15b可以促進HBV的復制與表達。2.miR-15b調(diào)節(jié)HBV復制與表達的分子機制研究(1)研究miR-15b調(diào)控HBV復制與表達是否通過直接靶向HBV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物而實現(xiàn)miRNA可能通過直接靶向HBV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或者靶向HBV轉(zhuǎn)錄和復制過程中重要的調(diào)控因子這兩種方式調(diào)控HBV的復制與表達。首先通過生物信息學分析miR-15b是否能夠直接靶向HBV基因組,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在HBV基因組上存在一個miR-15b可能的靶位點(417 nt-423 nt),將含此位點的序列構(gòu)建入miRNA靶基因鑒定的報告基因載體中,與miR-15b mimics共轉(zhuǎn)染細胞,報告基因結(jié)果顯示:miR-15b并不影響報告基因活性,即miR-15b不能通過直接靶向HBV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物而影響病毒的復制。(2)研究miR-15b調(diào)控HBV復制與表達是否通過靶向HBV復制調(diào)控相關因子而實現(xiàn)排除了miR-15b通過直接靶向HBV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物影響病毒復制的可能性,分析miR-15b可能通過靶向病毒復制相關的因子影響病毒復制。HBV復制過程中ccc DNA合成以及以ccc DNA為模板進行的基因轉(zhuǎn)錄是病毒復制的重要調(diào)控環(huán)節(jié)。HBV轉(zhuǎn)錄過程中啟動子與增強子等調(diào)控元件以及轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。排除了miR-15b直接靶向HBV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的可能性,推測miR-15b可能是通過影響HBV轉(zhuǎn)錄和復制過程中轉(zhuǎn)錄因子的表達,從而影響啟動子或者增強子活性,進而調(diào)控HBV的復制與表達。我們分析miR-15b對HBV啟動子和增強子的影響。將HBV啟動子和增強子基因建入報告基因載體p GL3-Basic中,與miR-15b mimics共同轉(zhuǎn)染細胞,報告基因的結(jié)果說明:miR-15b能促進HBV增強子Ⅰ(HBV EnhancerⅠ)的活性,而對其他調(diào)控元件不影響。我們推測miR-15b可能靶向調(diào)控HBV EnhancerⅠ活性的轉(zhuǎn)錄因子,從而影響其活性。生物信息學分析既是miR-15b的靶基因,又可以結(jié)合HBV EnhancerⅠ的分子,結(jié)果提示:肝細胞核因子1α(HNF1α)可能既是miR-15b靶分子,又是HBV EnhancerⅠ的結(jié)合分子,即HNF1α可能是miR-15b促進HBV EnhancerⅠ活性的中介分子。(3)miR-15b靶基因的驗證為了檢測HNF1α是否為miR-15b的靶基因,我們將HNF1α3’UTR及其靶位點突變的HNF1α3’UTR構(gòu)建入靶基因鑒定的報告基因載體中,與miR-15b mimics共轉(zhuǎn)染細胞,報告基因結(jié)果顯示:miR-15b能夠降低含有HNF1α3’UTR的報告基因活性,而不能影響靶位點突變的報告基因活性,這說明miR-15b能夠直接靶向HNF1α3’UTR。為了進一步研究miR-15b對細胞中HNF1αm RNA及蛋白表達的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-15b過表達抑制了HNF1αm RNA以及蛋白表達;而抑制內(nèi)源性miR-15b則促進了HNF1αm RNA以及蛋白表達。在小鼠體內(nèi)獲得了同樣的結(jié)果。上述結(jié)果表明HNF1α是miR-15b的靶基因。(4)HNF1α對HBV復制與表達的調(diào)控作用研究生物信息學預測表明HBV EnhancerⅠ含有HNF1α結(jié)合位點,為了進一步驗證生物信息學的預測分析結(jié)果,我們將HBV EnhancerⅠ及其靶位點突變的HBV EnhancerⅠ構(gòu)建入報告基因載體p GL3-Basic中,與HNF1α表達載體共轉(zhuǎn)染入細胞,報告基因結(jié)果顯示:HNF1α能夠降低HBV EnhancerⅠ的報告基因活性,而不能影響靶位點突變的報告基因活性,這說明HNF1α能夠直接靶向HBV EnhancerⅠ。進一步研究HNF1α對HBV復制及表達的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在細胞中過表達HNF1α可以抑制HBV復制及蛋白表達;而抑制內(nèi)源性HNF1α表達則可以促進HBV復制及蛋白表達。以上結(jié)果說明HNF1α能夠直接靶向HBV EnhancerⅠ,通過抑制HBV EnhancerⅠ活性抑制HBV的復制和基因表達。(5)HNF1α是miR-15b促進HBV復制與表達的中介分子上述實驗的結(jié)果表明HNF1α是miR-15b的靶基因,并且HNF1α能夠通過直接抑制HBV EnhancerⅠ活性來抑制HBV復制和基因表達,據(jù)此推測miR-15b可能直接靶向抑制HNF1α從而促進HBV EnhancerⅠ的活性,最終促進HBV復制與表達。為了驗證我們的猜想,我們利用雙報告基因系統(tǒng)研究了HNF1α在miR-15b促進EnhancerⅠ活性中所起的作用,報告基因的結(jié)果表明,miR-15b促進了HBV EnhancerⅠ的報告基因活性,但是外源加入HNF1α后,抵消了miR-15b對EnhancerⅠ的促進作用。同樣的,在HBV瞬時表達的Huh7細胞中,miR-15b能夠促進HBe Ag、HBs Ag的表達,但是外源加入HNF1α后則抵消了miR-15b對HBV抗原表達的促進作用。以上結(jié)果表明,HNF1α是miR-15b促進HBV Enhancer I活性以及促進HBV復制表達的中介分子。3.HBV感染宿主細胞對miR-15b表達的影響研究在前期的芯片結(jié)果及實驗中,我們發(fā)現(xiàn)隨著HBV復制水平的升高,miR-15b表達逐漸降低。為了檢測HBV是否調(diào)控miR-15b的表達,我們在細胞和動物水平分別檢測HBV的復制與表達對miR-15b表達的影響,發(fā)現(xiàn)HBV能夠抑制miR-15b的表達。進一步研究HBV編碼蛋白對miR-15b表達的影響,在瞬時表達HBV編碼蛋白的細胞中,發(fā)現(xiàn)HBV編碼的HBx蛋白能夠抑制miR-15b表達,而其他HBV編碼蛋白不影響miR-15b表達。檢測miR-15b在HBx轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟中表達的動態(tài)變化,發(fā)現(xiàn)HBx轉(zhuǎn)基因小鼠中miR-15b的表達隨時間進展逐漸降低。以上結(jié)果說明:HBV病毒的X蛋白抑制宿主細胞的miR-15b表達。我們的研究說明:miR-15b能夠通過直接靶向HBV EnhancerⅠ的負調(diào)控因子HNF1α從而促進了HBV EnhancerⅠ的活性,最終促進了HBV的復制與表達;另一方面,HBV特別是HBx的表達,能夠使細胞內(nèi)miR-15b的表達水平降低。HBV與miR-15b之間存在著負反饋調(diào)控作用。HBV通過負調(diào)控其復制促進因子miR-15b,負反饋調(diào)節(jié)自身復制,從而避免復制失控而被免疫系統(tǒng)識別。miR-15b與HBV之間互相調(diào)節(jié)在控制HBV復制、維持HBV的持續(xù)感染中發(fā)揮重要作用。
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【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R373.21

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