發(fā)布時間：2018-02-24 19:17

  本文關(guān)鍵詞： 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 TrkB 神經(jīng)再生 缺血 損傷 海馬腦片培養(yǎng)　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景和目的在哺乳動物大腦,可增殖的神經(jīng)祖/神經(jīng)干細胞在適當?shù)那闆r下可產(chǎn)生新的神經(jīng)元并將其整合到現(xiàn)有的神經(jīng)元環(huán)路,這一過程的存在稱為神經(jīng)再生,它可通過操縱內(nèi)源性神經(jīng)祖細胞的增殖和分化來提高細胞替代治療各種神經(jīng)退行性疾病的可能性。因此破解出調(diào)節(jié)神經(jīng)再生的“合適條件”,使得內(nèi)源性神經(jīng)替代系統(tǒng)轉(zhuǎn)化為治療干預(yù)措施顯得格外重要。生長因子是神經(jīng)干細胞發(fā)揮功能的重要影響因素。在活體和培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi),多種細胞外生長因子已被證明可促進神經(jīng)祖細胞的增殖和神經(jīng)再生。神經(jīng)營養(yǎng)因子屬于生長因子家族,包括神經(jīng)生長因子(NGF),腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF), neurotrophin-3(NT-3)和neurotrophin 4/5(NT-4/5),可參與神經(jīng)祖細胞的生存和增殖,在新生神經(jīng)元的分化和遷移過程中的自我修復(fù)中起重要作用。其中,BDNF因為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量最豐富、分布最廣泛的神經(jīng)營養(yǎng)因子而最為引人關(guān)注。BDNF幾乎調(diào)節(jié)了神經(jīng)元發(fā)育和功能的所有方面,包括誘導(dǎo)、增殖及分化。BDNF通過特異性結(jié)合和激活酪氨酸激酶受體(TrkB),或一個單一的泛神經(jīng)營養(yǎng)因子受體(p75NTR)發(fā)揮作用。目前認為BDNF-TrkB信號在神經(jīng)再生中起重要作用。在大腦的不同區(qū)域,BDNF或TrkB通過遺傳或化學(xué)方法發(fā)生功能性變化積極參與神經(jīng)再生的過程。體外,BDNF促進神經(jīng)祖細胞的增殖,在神經(jīng)細胞球培養(yǎng)中可增加神經(jīng)元含量。盡管如此,BDNF如何促進神經(jīng)再生,以及BDNF是如何影響神經(jīng)前體細胞的增殖和分化目前仍未能達成共識。與之前的報道不同的是,我們用海馬組織型切片培養(yǎng)(OHSCs)來探明BDNF對神經(jīng)再生的影響。與傳統(tǒng)的離體神經(jīng)再生研究的神經(jīng)元細胞培養(yǎng)相比,OHSCs似乎更適合研究體外新生和成年期的神經(jīng)再生,因為OHSCs包含各種神經(jīng)元和非神經(jīng)元物質(zhì),與生理條件更相近；此外,OHSCs可在數(shù)周內(nèi)保留大部分解剖通路、纖維聯(lián)系和內(nèi)在功能活性,可維護內(nèi)源性神經(jīng)元祖細胞自發(fā)生成新的神經(jīng)元,可以更好的模擬在體生理功能。與在體研究相比,用OHSCs可以以在體無法達到的BDNF濃度進行精確的實驗操作,并避免體內(nèi)BDNF不能通過血腦屏障的缺點更直觀的觀察其藥理作用,是很適合研究研究神經(jīng)再生的載體。因此,在本研究中我們應(yīng)用OHSCs研究BDNF對神經(jīng)再生的影響。目前為止,只有少數(shù)生長因子,諸如堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和表皮生長因子(EGF)在OHSCs上顯示出對神經(jīng)再生的復(fù)雜影響。此外,現(xiàn)有研究強烈提示BDNF和其關(guān)聯(lián)的受體TrkB參與調(diào)節(jié)了神經(jīng)再生過程。因此,我們使用OHSCs來研究BDNF對神經(jīng)再生的影響,用5-溴脫氧鳥苷(BrdU)標記法研究培養(yǎng)海馬腦片的神經(jīng)再生能力。神經(jīng)細胞的神經(jīng)元成熟由兩個神經(jīng)元標記物雙腎上腺皮質(zhì)激素(DCX)和神經(jīng)元特異性核蛋白(NeuN)表示。通過計算由這兩個標記物標記的陽性細胞,我們試圖在OHSCs系統(tǒng)中重新評估BDNF對神經(jīng)再生的影響,并探討B(tài)DNF-TrkB的濃度及時長選擇是否為神經(jīng)再生的關(guān)鍵因素之一。在成年哺乳動物大腦的神經(jīng)生長中心中,有自我更新能力的神經(jīng)干細胞(NSCs)聚集于室管膜下區(qū)(SVZ)和海馬顆粒下層(SGZ)。最近的研究表明,BDNF-TrkB對腦缺血可發(fā)揮神經(jīng)保護作用,可顯著促進由缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)再生,尤其是在海馬SGZ。腦缺血可引起海馬神經(jīng)元死亡,也可引起反應(yīng)性細胞增殖和神經(jīng)再生增加,這被認為是神經(jīng)元丟失的補償機制。缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)再生機制仍不甚明了,需更多證據(jù)闡明。OHSCs系統(tǒng)是研究缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)再生的方便而可靠的工具。離體研究中,可以用氧葡萄糖剝奪技術(shù)(OGD)對OHSCs造成類似于缺血引起的損傷。本研究中,我們首次設(shè)計了一系列實驗來證實OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)再生。缺血誘導(dǎo)損傷的強度與神經(jīng)再生程度是否有關(guān)仍未確定,我們對培養(yǎng)腦片施以不同持續(xù)時間的OGD來誘導(dǎo)出正常、輕度及重度損傷,試圖明確損傷強度和缺血誘導(dǎo)神經(jīng)再生之間的關(guān)系。鑒于BDNF-TrkB信號對控制缺血誘導(dǎo)神經(jīng)再生的重要性,我們進一步監(jiān)測了OGD誘導(dǎo)損傷后BDNF和TrkB在OHSCs的表達,了解神經(jīng)元損傷后BDNF-TrkB信號的變化及其與神經(jīng)再生的相關(guān)性。方法動物本研究所用C57BL小鼠來自于廣東省實驗動物中心。所有操作及飼養(yǎng)均遵循人道原則盡量減少動物的痛苦及使用數(shù)量。符合廣東省實驗動物管理條例并通過實驗動物倫理委員會審核。腦片培養(yǎng)海馬腦片培養(yǎng)準備如既往研究所述,并稍做改進。取產(chǎn)后6天幼鼠,斷頭取腦,分離海馬,迅速置于預(yù)冷的人工腦脊液(aCSF)中,此液配方為：NaCl 118mM,KCl2.5 mM, MgSO43 mM, NaH2PO4 1.1mM, NaHCO326 mM, CaCl2 1 mM和葡萄糖11 mM(所有試劑購自美國Sigma公司),置于95%02/5% C02飽和氣體中。隨后,用切片機(MA752,Campden儀器公司)切400μm厚冠狀切片,取相鄰的背側(cè)海馬冠狀切片,每個培養(yǎng)板中放入1-2片以待培養(yǎng)。在體視顯微鏡下,將浸泡于預(yù)冷、氧合Hank's平衡鹽溶液(Gibco, Invitrogen公司)中的海馬切片仔細分離,將沒有明顯損壞的腦片移至無菌多孔濾膜Millicell(Millipore公司),無血清培養(yǎng)基由50%MEM,18% HBSS,4mM L-谷酰胺,12 mM葡萄糖,4.5mM NaHCO3,20 mM蔗糖,100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素組成(所有試劑均購自Gibco或Sigma公司)。從每個海馬中挑選部位匹配的腦片,隨機分配到不同的培養(yǎng)條件組。由培養(yǎng)液中所用重組人BDNF(Immunological Sciences公司)和BDNF拮抗劑K252a(50 nM,Sigma公司)或TrkB-IgG(2ng/mL,RD系統(tǒng),)的不同濃度進行分組。碘化丙啶(PI)標記碘化丙啶(PI)是經(jīng)典的細胞活性探針,在細胞膜破裂后進入細胞與DNA結(jié)合發(fā)出紅色熒光。OGD處理后24小時,培養(yǎng)基內(nèi)給予20μg/mLPI,5分鐘后在熒光顯微鏡下觀察并照相,以觀察神經(jīng)元受損死亡程度。BrdU處理為即時標記有絲分裂后細胞,我們對DNA合成標記物BrdU的處理方法大致遵照傳統(tǒng)方式并略做改進。為確定合適的BrdU方案我們使用兩種改進辦法：第一種方法為在腦片制備30分鐘前對活體動物進行單次的給藥,將BrdU溶解在0.9% NaCl中,以50 mg/kg的劑量腹腔注射到幼鼠體內(nèi),此后腦片無需進行二次BrdU處理。第二種方法為BrdU處理兩次。先將BrdU注射到老鼠體內(nèi),然后在在腦片體外培養(yǎng)階段給予0.5 uMBrdU處理3天(DIV 0至DIV 3)。氧葡萄糖剝奪(OGD)處理常規(guī)OGD處理：OGD處理液由10 mM的甘露醇代替原有的培養(yǎng)基。在OGD處理前,OGD培養(yǎng)基加入6孔板,用95%N2和5%C02混合氣體預(yù)飽和,并37℃預(yù)熱。在正常培養(yǎng)的第8天(DIV 8),將海馬腦片從無菌室中轉(zhuǎn)移至預(yù)熱的OGD培養(yǎng)基,并置于一個密封箱內(nèi),予95%N2和5%C02混合氣體通氣10分鐘。箱密封后置于37℃孵育40分鐘。40分鐘后,重新置于原有培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。對照組使用正常培養(yǎng)基。免疫組織化學(xué)染色在體外培養(yǎng)第16天(DIV),在室溫條件下將培養(yǎng)腦片固定在4%PFA 1小時,然后轉(zhuǎn)移到30%蔗糖溶液中孵育24小時。隨后將腦片置于37℃ 2 M HCl30分鐘,在硼酸(0.1 M,pH 8.5)液中沖洗10分鐘。然后將腦片在PBS中徹底洗凈,用5%山羊血清與5%牛血清白蛋白封閉30分鐘。做免疫組化：將腦片與羊抗BrdU抗體(1：50,Sigma公司),鼠抗NeuN抗體(1：50,Chemicon公司)或鼠抗GFAP (1:200, Sigma公司)抗體、或鼠抗DCX抗體(1：100,Sigma公司)雙抗體在0.1%的Triton PBS孵育過夜,后在PBS徹底清洗3次共10分鐘；之后在PBS中用羊抗兔TRITC(1:50, Chemicon公司)和羊抗鼠Alexa 488 (1:50, Chemicon公司)二抗孵育雙染。對應(yīng)的陰性對照組未見特異性的二抗染色。腦片在PBS多次洗脫后,用DPX(Sigma公司)封片。免疫印跡體外培養(yǎng)的切片(每同一實驗條件下收集8個腦片)置于冷凍的RIPA緩沖液中勻漿。使用BCA蛋白測定試劑盒(Thermo Scientific公司)做蛋白定量分析。從整個組織勻漿提取15ug蛋白置于SDS-PAGE(4-20%凝膠,Bio-Rad公司),并轉(zhuǎn)移到PVDF轉(zhuǎn)移膜(Millipore公司),分別用不同抗體標記,用增強化學(xué)發(fā)光劑(ECL)顯色。使用Image J對免疫陽性條帶進行光學(xué)密度測量并定量分析。統(tǒng)計學(xué)處理在徠卡DMRA2顯微鏡下用徠卡DFC300FX攝像頭仔細觀察,對整個切片進行計數(shù)。為確保每張切片細胞總數(shù)類似,只選擇DAPI核染色平均密度及大小均近似的切片。量化實驗中,每個腦片的編碼和細胞計數(shù)由實驗人員雙盲檢測及處理。統(tǒng)計分析和圖形制作使用SPSS19.0軟件(美國)。使用Excel繪圖,結(jié)果用均值士標準差(mean±SD)表示。多組樣本比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA),兩兩比較或組間比較采用Bonferroni, LSD, Student-Newman-Keuls(在結(jié)果中已注明)。P0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1.海馬腦片培養(yǎng)中的神經(jīng)再生為尋找一個更加優(yōu)化的BrdU標記方法,本研究對文獻報道的BrdU標記方法進行比較。我們應(yīng)用兩種方案給予BrdU:1)方案1,僅在取腦前對活體動物進行單次的給藥(BrdU,50mg/kg);2)方案2,在方案1的基礎(chǔ)上在腦片體外培養(yǎng)階段給予0.5 uMBrdU處理3天(DIV 0至DIV 3)。兩種方案均在DIV 16后進行腦片固定,利用抗BrdU抗體進行免疫熒光標記,結(jié)合神經(jīng)元標志物DCX、NeuN和星型膠質(zhì)細胞標志物GFAP進一步分析新生細胞的類型。用方案1標記BrdU,大于70%BrdU+細胞分布于齒狀回的顆粒細胞層(GCL),其余細胞主要散在分布于門區(qū)、CA1和CA3區(qū)；用方案2標記BrdU, BrdU+細胞彌散于整個腦片,陽性細胞數(shù)大量增加。為了證實我們的推測,我們應(yīng)用星型膠質(zhì)細胞標志物GFAP與BrdU進行雙重標記。應(yīng)用標記方案2,每個腦片大約有213+29個BrdU+細胞,大量BrdU+(85%)細胞表現(xiàn)為GFAP陽性。因此,BrdU+/GFAP+細胞可反應(yīng)膠質(zhì)細胞的增殖水平。我們進一步利用成熟神經(jīng)元的標記物NeuN與BrdU進行雙重標記,僅有極少數(shù)細胞(平均8±2.3,n=6)表現(xiàn)為NeuN+/BrdU+,陽性細胞主要分布在齒狀回顆粒細胞層,在CA1和CA3區(qū)數(shù)量極少。這些NeuN+/BrdU+細胞的BrdU信號表現(xiàn)為染色質(zhì)的斑點樣改變。與之相區(qū)別,GFAP+/BrdU+細胞的BrdU信號表現(xiàn)為均勻的片狀深度染色。這些染色特征對快速判斷新生神經(jīng)元具有重要作用。2. BDNF-TrkB信號與神經(jīng)再生的關(guān)系目前,BDNF在海馬腦片中的神經(jīng)再生作用尚未見報道。因此,為了闡明BDNF在細胞增殖與分化的作用,我們應(yīng)用上述BrdU標記方案2,在培養(yǎng)過程中加入梯度濃度的BDNF (1,10,20,40,80,160,320ng/mL),在培養(yǎng)16天后(DIV16)進行免疫熒光雙標記鑒定,以研究BDNF對神經(jīng)元的影響。不同的免疫標志物(NeuN, DCX, GFAP)分別與BrdU進行雙重標記,對雙重標記的細胞進行計數(shù)。BDNF的補充導(dǎo)致BrdU+/DCX+和BrdU+/NeuN+細胞數(shù)增加,呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。與對照組相比,高濃度(40～320 ng/mL)補充BDNF導(dǎo)致的新生神經(jīng)元細胞數(shù)增加有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05,n=6),峰值響應(yīng)在80 ng/mL. BrdU+/DCX+細胞數(shù)量是BrdU+/NeuN+細胞數(shù)量的3～4倍。分析新生的BrdU+/GFAP+星形膠質(zhì)細胞的數(shù)量,在不同濃度BDNF補充的培養(yǎng)基中沒有看到顯著變化(P0.05,n=6)。我們進一步用特異性酪氨酸激酶TrkB抑制劑K252a和BDNF清除劑TrkB-IgG阻斷BDNF-TrkB信號以明確BDNF的作用。結(jié)果表明,BDNF-TrkB信號的雙封閉雖然不能完全消除補充BDNF的影響(與對照組相比P0.05,n=6),但可削弱新生神經(jīng)元數(shù)量的增加(將BrdU+/DCX+和BrdU+/NeuN+細胞數(shù)匯總,與80 ng/mL BDNF相比p0.05,n=6)。為了解內(nèi)源性BDNF在神經(jīng)再生的重要性,我們用K252a和TrkB-IgG處理腦片,并且不補充外源性BDNFo結(jié)果表明K252a對腦片的存活沒有影響,但與對照組相比可顯著降低神經(jīng)再生。3.在海馬腦片培養(yǎng)中外源性BDNF補充的時機選擇鑒于BDNF-TrkB信號的增強可以促進神經(jīng)再生,我們進一步研究了在培養(yǎng)過程中BDNF和TrkB表達的動態(tài)變化。使用不補充外源性BDNF、其他培養(yǎng)條件不變的培養(yǎng)腦片作為對照組,我們研究了培養(yǎng)腦片BDNF和TrkB蛋白水平的改變。BDNF的表達在培養(yǎng)后第二天先是減少到35%,然后反彈約60%(P0.05,n=4)。與BDNF不同的是,TrkB的蛋白水平隨培養(yǎng)腦片的逐漸成熟不斷上調(diào),從培養(yǎng)第二天開始即有顯著性升高(P0.05,n=4)。在海馬腦片培養(yǎng)中,隨時間依賴的BDNF和TrkB表達的動態(tài)演變提示BDNF-TrkB的信號強度在神經(jīng)元成熟過程中有動態(tài)調(diào)節(jié)過程。隨后,我們探討了上調(diào)BDNF信號強度對神經(jīng)再生的影響是否與神經(jīng)元成熟有關(guān)。內(nèi)源性的BDNF和TrkB表達水平的變化可能影響外源性BDNF的促神經(jīng)再生作用。正如前面實驗證實,在培養(yǎng)期間,內(nèi)源性的BDNF和TrkB表達水平呈現(xiàn)一定的特征性改變。我們推測,外源性BDNF的補充需要一定的時機選擇。根據(jù)海馬腦片培養(yǎng)期間內(nèi)源性的BDNF和TrkB表達特征,我們將腦片培養(yǎng)分為培養(yǎng)早期(DIV0-8)和培養(yǎng)后期(DIV9-16),2個時期內(nèi)均有外源性BDNF補充,分別比較外源性BDNF在不同時間段補充對新生神經(jīng)元的促進作用。在第16天(DIV 16)計數(shù)BrdU+/DCX+細胞,結(jié)果顯示在培養(yǎng)后期給予外源性BDNF并未顯著促進神經(jīng)再生。然而在培養(yǎng)早期給予相同劑量的外源性BDNF,BrdU+/DCX+細胞數(shù)量顯著增多(與對照組相比,P0.05,n=5),具有顯著的促神經(jīng)再生的效應(yīng)。在培養(yǎng)早期補充BDNF組新生神經(jīng)元的平均數(shù)量與前16天全程持續(xù)補充BDNF組的新生神經(jīng)元平均數(shù)相似。早期補充BDNF與晚期補充所致的神經(jīng)發(fā)生數(shù)量有顯著差異(P0.05,n=5)。結(jié)合內(nèi)源性的BDNF和TrkB表達特征,結(jié)果提示外源性BDNF的補充與內(nèi)源性的BDNF和TrkB表達水平有關(guān),適度的BDNF-TrkB信號強度可能是神經(jīng)元再生的重要影響因素。4海馬腦片培養(yǎng)氧糖剝奪(OGD)模型誘導(dǎo)新生神經(jīng)元的產(chǎn)生盡管既往報道在海馬腦片培養(yǎng)中氧糖剝奪(OGD)可誘導(dǎo)新生神經(jīng)元的產(chǎn)生,然而我們第一章研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)海馬腦片培養(yǎng)本身有一定數(shù)量的新生神經(jīng)元。因此,在OGD處理后鑒定的新生神經(jīng)元可能是與腦片培養(yǎng)本身有關(guān)。為了進一步證實OGD可誘導(dǎo)或促進新生神經(jīng)元的生成,本研究設(shè)計4個實驗組：對照組1,BrdU處理時間在培養(yǎng)前3天(DIV0-3)；對照組2,給予兩次BrdU,分別在DIV0-3及DIV8-11；OGD處理1組,在對照組1的基礎(chǔ)上于DIV8給予氧糖剝奪；OGD處理2組,在對照組2的基礎(chǔ)上于DIV8給予氧糖剝奪(圖2-1a)。在海馬腦片培養(yǎng)DIV16用DCX與BrdU抗體進行熒光雙標記,對DCX+/BrdU+細胞(新生神經(jīng)元)計數(shù)。如圖2-1b所示,在OGD處理前給予BrdU僅能標記腦片培養(yǎng)過程中自發(fā)發(fā)生的新生神經(jīng)元,OGD 1組與對照組1并無顯著差異,提示OGD處理對自發(fā)發(fā)生的新生神經(jīng)元的存活和分化影響不顯著。在OGD處理后給予BrdU能標記在OGD發(fā)生后發(fā)生增殖的神經(jīng)祖細胞。比較OGD 2組和對照組2,可見DCX+/BrdU+細胞數(shù)有顯著差異(P0.05),OGD處理可增高新生神經(jīng)元的數(shù)量。同樣,OGD 2組的DCX+/BrdU+細胞數(shù)顯著高于OGD 1組,提示OGD處理可能主要通過誘導(dǎo)神經(jīng)祖細胞增殖。5新生神經(jīng)元的產(chǎn)生依賴于海馬腦片培養(yǎng)氧糖剝奪(OGD)損傷程度上述結(jié)果顯示OGD可能通過誘導(dǎo)神經(jīng)祖細胞的增殖促進新生神經(jīng)元的產(chǎn)生。我們推測,神經(jīng)元的受損程度可能與OGD的誘導(dǎo)增殖能力有關(guān)。因此,實驗中設(shè)計三種OGD處理時間,以文獻報道的OGD處理時間定義為1)常規(guī)OGD組,OGD持續(xù)時間50分鐘；2)輕度OGD處理組,處理時間為常規(guī)時間的一半,25分鐘；3)重度OGD組,OGD持續(xù)時間100分鐘。在DIV 9,即OGD處理后1天給予PI染色鑒定培養(yǎng)腦片的細胞損傷程度。結(jié)果顯示,細胞損傷水平與OGD處理時間成正相關(guān)。在培養(yǎng)前三天用BrdU處理的腦片中,在OGD處理后立即檢查BrdU+細胞,可測定OGD誘導(dǎo)的細胞增殖和神經(jīng)再生。以對照組2的BrdU給予方法,比較三種OGD處理時間對培養(yǎng)的海馬腦片新生神經(jīng)元生成的影響。結(jié)果顯示,輕度OGD和常規(guī)OGD組顯著增加DCX+/BrdU+細胞數(shù),顯著提高海馬腦片培養(yǎng)的新生神經(jīng)元生成(P0.05,n=5)。常規(guī)OGD組誘導(dǎo)的新生神經(jīng)元數(shù)量比輕度OGD組顯著增高,嚴重OGD組誘導(dǎo)產(chǎn)生的新生神經(jīng)元較其它組都少,與輕度OGD組和常規(guī)OGD組相比、甚至與對照組相比均有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05, n=5,ANOVA and post-hoc LSD test),嚴重OGD組的反向作用原因可能是嚴重的缺氧導(dǎo)致培養(yǎng)腦片的神經(jīng)祖細胞或新生的神經(jīng)元死亡,最終表現(xiàn)為在DIV16檢測的新生神經(jīng)元數(shù)量較少。6海馬腦片培養(yǎng)OGD損傷后BDNF與TrkB的表達變化前面已經(jīng)證明,內(nèi)源性BDNF及TrkB的蛋白表達是隨著體外海馬腦片培養(yǎng)的時間動態(tài)變化的。在腦片培養(yǎng)的過程中,神經(jīng)元生長經(jīng)歷了不同的過程,包括損傷、修復(fù)、神經(jīng)元的再生與成熟過程等,這些過程可能與BDNF-TrkB信號強度相互關(guān)聯(lián)。而OGD的損傷后,內(nèi)源性BDNF及TrkB的蛋白表達又是如何變化的?本研究利用Western blot的方法測定OGD處理后不同培養(yǎng)時間點的BDNF與TrkB的相對表達水平。以未受OGD處理的腦片(DIV 8)為對照,結(jié)果發(fā)現(xiàn)TrkB和BDNF蛋白表達改變相匹配,在OGD早期急劇下調(diào),在OGD后期急速回升。BDNF在24小時和48小時顯著低于對照組(P0.05),隨后快速回升,并在OGD處理6天后和8天后(DIV 14和DIV 16)顯著高于對照組(P0.05)。TrkB則在OGD處理48小時后的表達顯著降低,而在OGD處理后8天顯著高于對照組。與同時期的正常腦片培養(yǎng)相比,BDNF及TrkB蛋白的表達在OGD處理后4天并未有顯著差異,而在OGD處理后OGD處理后8天顯著增高(P0.05)。結(jié)果提示,OGD誘發(fā)細胞損傷后的早期(4天內(nèi)),BDNF及TrkB蛋白的表達下調(diào)；在損傷修復(fù)期(6-8天),與未受OGD處理的同時期腦片相比,BDNF及TrkB蛋白的表達顯著增高,證明OGD處理本身可促進BDNF及TrkB蛋白的表達。結(jié)論1.海馬腦片培養(yǎng)是研究神經(jīng)再生的一個重要工具。2.外源性補充BDNF可成濃度依賴地促進海馬腦片培養(yǎng)的新生神經(jīng)元生成。3.阻斷內(nèi)源性或外源性的BDNF均可抑制海馬腦片培養(yǎng)的新生神經(jīng)元生成。4.海馬腦片培養(yǎng)過程中內(nèi)源性BDNF與TrkB蛋白表達是動態(tài)變化的。在培養(yǎng)早期,內(nèi)源性BDNF相對不足。5.外源性補充BDNF的促神經(jīng)再生作用具有時機性。在培養(yǎng)早期給予外源性BDNF補充最為關(guān)鍵,可能與培養(yǎng)早期的內(nèi)源性BDNF相對不足有關(guān)。6.在海馬腦片中給缺氧缺糖處理后,細胞存在不同程度的損傷, 并在損傷后的修復(fù)期新生神經(jīng)元增加。7.培養(yǎng)的海馬腦片給予不同維持時間的缺氧處理,細胞損傷水平與處理時間成正相關(guān)。細胞損傷較小時,誘導(dǎo)生成的新生神經(jīng)元數(shù)量也較小。細胞損傷過大,培養(yǎng)的海馬腦片的新生神經(jīng)元數(shù)量并未相應(yīng)增高,相反,顯著低于正常對照。8.在培養(yǎng)的海馬腦片中,缺氧處理后的細胞損傷早期內(nèi)源性BDNF與TrkB的表達水平顯著下降；而在缺氧處理后期,即細胞修復(fù)期,內(nèi)源性BDNF與TrkB的表達水平迅速增高,并在缺氧處理后8天,顯著高于正常對照。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R338

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本文編號：1531397