發(fā)布時(shí)間：2018-02-24 23:33

  本文關(guān)鍵詞： HisArg FⅧ∶C 蛋白穩(wěn)定性 DNA突變 血友病A　出處：《中國(guó)輸血雜志》2013年10期 　論文類型：期刊論文

【摘要】：目的探討His99Arg突變致患者血漿凝血因子Ⅷ(FⅧ)活性檢測(cè)結(jié)果變化大及一期法和二期法FⅧ活性檢測(cè)結(jié)果不相符的分子發(fā)病機(jī)制。方法以凝固法檢測(cè)先證者及家系成員凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT),FⅧ活性(FⅧ∶C)、FⅨ∶C等。基于APTT途徑的一期法和基于發(fā)色底物法途徑的二期法檢測(cè)FⅧ∶C,測(cè)定患者血漿分別在37、25、4、-20及-80℃時(shí)的FⅧ∶C,測(cè)定56℃時(shí)患者血漿FⅧ∶C穩(wěn)定性(一期法)及FⅧ蛋白的熱穩(wěn)定性(EILSA法);以長(zhǎng)鏈PCR及序列特異PCR檢測(cè)F8基因內(nèi)含子22及內(nèi)含子1倒位,對(duì)F8基因所有外顯子及其側(cè)翼序列測(cè)序;以PyMOL軟件分析FⅧ突變蛋白的三維結(jié)構(gòu);構(gòu)建His99Arg突變表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后博萊霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株,測(cè)定培養(yǎng)上清FⅧ∶C穩(wěn)定性。結(jié)果先證者血漿FⅧ∶C:一期法檢測(cè)為14.7%,二期法檢測(cè)為1.2%。和正常人相比,患者血漿在室溫放置2 h時(shí)FⅧ∶C迅速下降,2 h后FⅧ∶C基本穩(wěn)定在1%左右;在4℃孵育時(shí)FⅧ∶C下降的趨勢(shì)和室溫放置時(shí)基本相似;FⅧ∶C在37℃隨孵育時(shí)間延長(zhǎng)而明顯下降,孵育10 min后FⅧ∶C下降了93.9%;不管在-20還是在-80℃,患者血漿放置1個(gè)月后,其FⅧ∶C基本完全喪失;56℃時(shí)患者血漿FⅧ∶C的半衰期僅為正常人的1/4(2 min/8 min);在56℃時(shí)患者FⅧ穩(wěn)定性下降明顯,重鏈和輕鏈解離速度是正常人的3倍(2 min/6 min)。F8基因分析發(fā)現(xiàn)患者存在g.30716AG突變而導(dǎo)致His99Arg氨基酸改變;三維結(jié)構(gòu)模型分析顯示His99Arg突變后,Arg99殘基與His1957及Ser1959殘基間的距離由3.49和3.42姒分別變?yōu)?.19和2.39姒。體外表達(dá)研究顯示培養(yǎng)上清液中的FⅧ具有與患者血漿FⅧ相似的不穩(wěn)定表現(xiàn)。結(jié)論 His99Arg突變引起FⅧ空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化和FⅧ重鏈和輕鏈解離速度加快。His99Arg突變后FⅧ∶C的穩(wěn)定性明顯下降,造成常規(guī)條件下FⅧ∶C檢測(cè)結(jié)果變化大及一期法和二期法FⅧ∶C檢測(cè)結(jié)果的不相符。
[Abstract]:Objective to investigate the molecular pathogenesis of the change of plasma coagulation factor 鈪，

本文編號(hào)：1532196