本文關鍵詞： 阿爾茨海默病 淀粉樣蛋白 蠶蛹 家蠶生物反應器 老年斑　出處：《浙江大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：眾多研究表明,β淀粉樣蛋白(Ap)的沉積導致腦內老年斑和淀粉樣血管病的形成是阿爾茨海默癥(AD)發(fā)病機制中的關鍵環(huán)節(jié)。老年斑主要由β淀粉樣蛋白Aβ40和Aβ42的聚集而形成,Aβ42是其中最重要的毒性成分。Aβ的主動免疫對不同的AD轉基因鼠動物模型均有治療作用,而Aβ肽注射疫苗在臨床試驗中表現(xiàn)了積極的治療作用但出現(xiàn)了一定比例的副作用。尋找既能高效抑制老年斑的形成,又能消除臨床上不良反應的疫苗成了研究的焦點。本研究為了使疫苗具有更溫和的抗原-抗體反應,采取了Aβ蛋白在家蠶生物反應器表達并制成口服粉劑的方式；為了增強Aβ基因的表達并降低TH1型免疫反應的不良影響,使Aβ肽與霍亂毒素B亞基(CTB)融合表達；此外保留Aβ肽B細胞表位同時減少T細胞表位也可以降低TH1型免疫反應的副作用,因此選擇決定B細胞表面抗原的Ap15肽作為抗原有可能避免Aβ42全肽免疫的不良反應。蠶蛹富含人體所需的各種氨基酸及不飽和脂肪酸,且蠶蛹蛋白本身具有許多生理和藥理活性,可以用作醫(yī)藥中間體。另外,將蠶蛹作為接種載體,具有操作簡便、回收便捷、表達量高等優(yōu)點。本研究嘗試用家蠶生物反應器,并運用與能夠增強黏膜免疫效果的CTB融合表達的方式分別生產Aβ42, CTB-AP42和CTB-Aβ15蛋白,并分別用表達Aβ42, CTB-Aβ42和CTB-Aβ15蛋白的工程蠶蛹制備蠶蛹凍干粉以更安全的口服的形式免疫阿爾茨海默癥模型小鼠。采用水迷宮、免疫組化、ELISA、圖像分析技術等手段,從行為、細胞、分子水平來評價蠶蛹表達的Aβ42, CTB-Aβ42和CTB-Aβ15蛋白對阿爾茨海默癥的防治效果。本研究通過基因重組技術將Aβ42, CTB-Aβ42和CTB-Aβ15基因克隆入家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)轉移載體質粒pBacPAK8中,并將重組質粒pBacPAK8-Aβ42, pBacPAK8-CTB-Aβ42和pBacPAK8-CTB-Aβ15與線性化的家蠶桿狀病毒Bm-BacPAK6的DNA在家蠶BmN細胞中共轉染,獲得重組家蠶桿狀病毒BmNPV-Aβ42, BmNPV-CTB-Aβ42和BmNPV-CTB-Aβ15。用重組家蠶桿狀病毒BmNPV-Aβ42, BmNPV-CTB-Aβ42和BmNPV-CTB-Aβ15感染家蠶BmN細胞和蠶蛹,得到成功表達；并用BmNPV-Aβ42和BmNPV-CTB-Aβ15感染家蠶五齡幼蟲,獲得成功表達。其中,Aβ42蛋白在BmN細胞內的表達水平最高可達2.2μg/2×106細胞,五齡幼蟲血淋巴中可達2 μg/mL,蠶蛹中表達量可達0.3 μg/g；CTB-Aβ42融合蛋白在細胞中的表達量可達10 μg/2×106細胞,蠶蛹中表達量可達0.5μg/g; CTB-Aβ15融合蛋白在細胞中的最大表達量可達5μg/2×106細胞,五齡幼蟲血淋巴中可達0.8μg/mL,而在蠶蛹中的表達量能夠達到10μg/g。蠶蛹表達的Aβ42, CTB-Aβ42和CTB-Aβ15重組蛋白作為口服AD劑型均可誘導AD模型B6C3-Tg小鼠產生抗Ap抗體,與生理鹽水對照組比較有顯著性差異,其中CTB-Aβ42和CTB-Aβ15免疫組誘導產生Ap抗體的滴度較Aβ42組局(CTB-Aβ42組：1：420,CTB-Aβ15組：1：390,Aβ42組：1：300,對照組：1：100)。用來評價小鼠的記憶和認知能力的水迷宮測試定位航行實驗中,服用了表達Aβ42, CTB-Aβ42和CTB-Aβ15重組蛋白的蠶蛹源口服AD劑型組的小鼠,在第四,第五天的訓練中,表現(xiàn)優(yōu)異,潛伏期縮短,其中CTB-Aβ42免疫組和CTB-Aβ15免疫組與服用生理鹽水的對照組形成顯著性差異。第六天撤掉平臺的空間搜索實驗中,三個口服AD劑型組與對照組相比在曾放置平臺的目標象限停留的時間都更長,穿越平臺區(qū)的平均次數(shù)更多(CTB-Aβ42組：2.2,CTB-Aβ15組：1.8,Aβ42組：1.8,對照組：0.6),CTB-Aβ42免疫組與生理鹽水對照組差異顯著。對腦內老年斑的免疫組化分析顯示,三個口服AD劑型免疫組的小鼠與對照組相比,在腦的前葉,海馬和皮質部分都有不同程度的老年斑的減少。實驗結果顯示,對照組和Aβ42劑型免疫組的小鼠腦內的老年斑斑塊較大,而服用表達CTB-Aβ42和CTB-Aβ15融合蛋白的蠶蛹免疫組的小鼠腦內的老年斑斑塊相對小而分散,在腦內所占的相對面積較小。B6C3-Tg小鼠腦內可溶和不可溶的Aβ42肽的含量測定發(fā)現(xiàn)服用表達CTB-Aβ42和CTB-Aβ融合蛋白的蠶蛹免疫組的小鼠腦內無論是可溶和不可溶的Aβ42肽都顯著低于對照組小鼠。綜合評價提示,蠶蛹表達的Aβ42, CTB-Aβ42和CTB-Aβ15重組蛋白作為口服制劑在AD模型小鼠上具有明顯改善AD小鼠的阿爾茨海默病病癥,有望開發(fā)為AD口服疫苗。
[Abstract]:In order to improve the expression of A尾42 , CTB - AP42 and CTB - A尾15 protein and to reduce the adverse effects of TH1 - type immune response , it is suggested that the expression of A尾42 , CTB - A尾42 and CTB - A尾15 protein can be used as an intermediate . The results showed that the expression of CTB - A尾42 , CTB - A尾42 and CTB - A尾15 recombinant protein could induce the AD model of AD model . The titers of CTB - A尾42 and CTB - A尾15 immune groups were higher than those in normal saline control group ( CTB - A尾42 group : 1 : 390 , A尾42 group : 1 : 300 , control group : 1 : 100 ) . The results showed that both soluble and insoluble A尾42 and CTB - A尾42 and CTB - A尾15 were significantly lower in the brain than in the control group . The results showed that both soluble and insoluble A尾42 and CTB - A尾42 were significantly lower in the brain .

【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R749.16;R-332

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本文編號：1526927