本文關鍵詞： 腸道微生物 慢傳輸型便秘 動物模型 糞菌移植 16S rDNA 高通量測序　出處：《南京大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：隨著分子生物學、微生物學以及生物信息學技術的發(fā)展,有關腸道微生物與人類疾病相關性的研究越來越深入。慢傳輸型便秘作為一類發(fā)病率高、診療復雜且容易反復的胃腸道疾病,其發(fā)病機制尚未完全清楚,近年來腸道微生物領域取得的突破為慢傳輸型便秘提供了新的診療策略�；诼齻鬏斝捅忝鼗颊唧w內(nèi)腸道微生物群落組成結構的變化,本研究試圖采用糞菌移植的方式構建慢傳輸型便秘的動物模型,并對其腸道微生物的多樣性進行分析,從而探討出腸道微生物在慢傳輸型便秘發(fā)生發(fā)展過程中所發(fā)揮的作用。糞菌活力是造模成功與否的關鍵,因此研究首先采用LIVE/DEAD細菌死活染色技術,對造模所需的糞便樣品進行活力分析。根據(jù)臨床上采集糞便的實際情況,選取兩種糞菌保存方法,即新鮮糞便直接-80℃保存以及新鮮糞便制成30%甘油糞菌液后-8℃保存,分別對兩種保存方法下不同時間段內(nèi)的糞菌活力進行定性分析和定量分析,結果顯示糞便直接保存在-8℃中能夠在短時間內(nèi)保持糞菌的活力,但連續(xù)兩個月之后活菌比例下降至68.3%,明顯低于含30%甘油糞菌液的活菌比例(76%)。由于糞菌移植的時間長達2個月,且臨床上收集糞便具有較高的不確定性,因此實驗中將收集的新鮮糞便預先凍存在-80°C中,12h內(nèi)制成含30%甘油糞菌液再進行長期保存。按照供體選擇標準選取1例健康人和2例便秘患者,分別將其糞便制成糞菌液后,通過灌胃的方式移植給C57BL/6鼠,為降低小鼠體內(nèi)原有的腸道微生物負荷,提高糞菌移植的效率,C57BL/6鼠在糞菌移植之前進行4周的抗生素處理。此外,本研究還采用了復方地芬諾酯法建立慢傳輸型便秘模型,以此作為陽性對照。結果顯示,抗生素處理后的小鼠盲腸增大,可培養(yǎng)的腸道微生物數(shù)量顯著降低,表現(xiàn)出無菌鼠的特征。與復方地芬諾酯法造模的小鼠類似,移植便秘患者糞菌小鼠的24h排便量、糞便含水量、Cajal間質(zhì)細胞的數(shù)量于明顯低于對照組,且糞菌移植法造模的小鼠結腸內(nèi)出現(xiàn)氣體滯留的現(xiàn)象,與慢傳輸型便秘的臨床癥狀相似,表明造模成功。提取各組小鼠的糞便DNA,利用16S rDNA二代測序技術分析腸道微生物的群落組成結構,結果顯示抗生素處理后的小鼠腸道微生物數(shù)量及物種豐富程度顯著降低,8周的糞菌移植能夠重建小鼠體內(nèi)的腸道微生物,物種的組成及豐度與供體相比呈現(xiàn)出較高的相似度,達到"人源化"水平。此外,便秘小鼠的腸道微生物與空白對照組以及移植健康人糞菌的小鼠相比有著明顯的差別,利用LEfSe尋找差異顯著的物種,分析表明小鼠腸道中的優(yōu)勢菌群由擬桿菌屬(Barteroides)轉變?yōu)槊菥鷮?Lachnospira)、δ 變形菌(Deltaproteobacteria)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、Akkermansia屬以及疣微菌屬(Verrucomicrobia)�；诖搜芯拷Y果,未來可以人為地構建出一套腸道菌群進行慢傳輸型便秘模型的建立,從而規(guī)范建模的方法以及模型的判定標準,以便更好地研究腸道微生物與宿主相互作用的具體機制,為慢傳輸型便秘發(fā)病機制研究以及治療手段構建奠定基礎。
[Abstract]:With the development of molecular biology, microbiology and bioinformatics technology, research about the correlation between intestinal microflora and human disease more and more deeply. The slow transit constipation as a kind of high incidence, diagnosis and treatment of complex and prone to recurrent gastrointestinal diseases, its pathogenesis has not yet entirely clear, achieved in the field of gut microbes in recent years breakthrough to slow constipation provides a new therapeutic strategy. Changes in structure of slow transit constipation in patients with intestinal microbial community based on, this study attempts to construct the animal model of slow transit constipation by fecal bacteria transplantation method, and the diversity of gut microbes were analyzed, so as to explore its occurrence and development process of intestinal microflora in the slow transit constipation. Fecal bacteria activity is the key to the success of the model, so the research firstly by LIVE/DEAD bacteria. Dyeing technology, analysis of the model of energy required for fecal samples. According to the actual situation of clinical stool samples, select two kinds of fecal bacteria preservation methods, namely direct stool -80 C storage and fresh stool made of 30% fecal bacteria liquid after glycerol stored at -8, fecal bacteria activity of the two kinds of different preservation methods the time period of the qualitative analysis and quantitative analysis, the results revealed that saved directly to keep fecal bacteria in a short period of time at -8 DEG C and vitality, but after two months the proportion of living bacteria decreased to 68.3%, significantly lower than the proportion of living bacteria of fecal bacteria containing 30% glycerol (76%). The fecal bacteria transplantation the time for 2 months, and the clinical collected stool with high uncertainty, so the experiment will collect the fresh feces of pre frozen -80 degrees C, 12h made of fecal bacteria containing 30% glycerol solution for long-term preservation. According to donor selection criteria A total of 1 healthy people and 2 cases of patients with constipation, the feces were made of fecal bacteria liquid after transplantation through gavage to C57BL/6 rats, mice in order to reduce the original intestinal microbial load, improve the efficiency of fecal bacteria transplantation, C57BL/6 rats were born 4 weeks of anti hormone treatment before FMT. In addition, this study also uses compound diphenoxylate method to establish the model of slow transit constipation, as a positive control. The results showed that the increase of antibiotic treated mice cecum, the numbers of culturable gut microbes decreased significantly, characterized by sterile rats. With compound diphenoxylate of modeling mice is similar to that of 24h stools fecal transplantation patients with constipation bacteria in mice, fecal water content, Cajal and Leydig cell numbers to significantly lower than the control group, gas retention phenomenon of mouse colon and fecal bacteria transplantation model in clinical and slow transit constipation The symptoms are similar, indicating that the animal model successfully. DNA extracted from feces of mice in each group, analysis of the composition and structure of intestinal microbial community using 16S rDNA two generation sequencing technology, the results showed the antibiotic treated mice intestinal microbial quantity and species richness decreased, fecal bacteria 8 weeks of transplantation to the intestinal microbial reconstruction in mice, composition and abundance compared with donor species showed high similarity to "humanized" level. In addition, intestinal microflora and the blank control group and constipation mice transplanted healthy human fecal bacteria compared with the obvious difference, using LEfSe to find significant differences between species, analysis showed that the dominant bacteria in the intestinal tract of mice by fitting group bacillus (Barteroides) into Mao Spirillum (Lachnospira), delta Proteobacteria (Deltaproteobacteria), Desulfovibrio (Desulfovibrio), Akkermansia and Verrucomicrobium (Ver Rucomicrobia). Based on the results of the research, the future can be artificially constructed to establish a set of intestinal microflora of slow transit constipation model, thus the standard modeling method and standard model, in order to better study the specific mechanism of the gut microbiota and host interactions, lay a foundation for the construction research of the pathogenesis of slow transit constipation as well as treatment.

【學位授予單位】：南京大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R574.62;R-332

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本文編號：1521615