本文關鍵詞： 經(jīng)典Wnt信號通路 β-catenin LisH2 胚胎發(fā)育 結(jié)直腸癌　出處：《浙江大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：經(jīng)典Wnt信號通路(Wnt/β-catenin信號通路)是一類由分泌型糖蛋白Wnt介導的信號轉(zhuǎn)導途徑,在動物胚胎發(fā)育中參與調(diào)節(jié)細胞增殖與分化、背腹體軸建立、組織和器官形成,以及成體組織穩(wěn)態(tài)的維持等一系列生理過程。其異常與發(fā)育缺陷、惡性腫瘤、代謝綜合征、神經(jīng)退行性病變等諸多人類疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關。因此,深入研究經(jīng)典Wnt信號通路的分子調(diào)控機理,對相關疾病的診治具有重要的理論意義和潛在的臨床應用價值。經(jīng)典Wnt信號通路主要通過提高細胞質(zhì)內(nèi)β-catenin的蛋白穩(wěn)定性,促進其移位至細胞核而激活下游靶基因的表達。當細胞沒有接收Wnt信號時,胞質(zhì)內(nèi)的β-catenin被由支架蛋白Axin、腺瘤性息肉病基因蛋白產(chǎn)物(adenomatous polyposis coli, APC)、糖原合酶激酶3(glycogen synthase kinase 3, GSK3)和酪蛋白激酶1 (casein kinase 1, CK1)等組成的降解復合物捕獲,經(jīng)泛素化后由蛋白酶體降解,故β-catenin無法進入細胞核激活靶基因的轉(zhuǎn)錄。當細胞外存在較高濃度的Wnt配體時,Wnnt能結(jié)合細胞膜上的受體,招募Axin移位至細胞膜,促使降解復合物解體。β-catenin不再受到降解復合物的控制,因此在胞質(zhì)內(nèi)累積并進入細胞核,結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子T細胞因子／淋巴增強子因子(T cell factor/lymphoid enhancer factor, TCF/LEF)促進下游靶基因的表達。由此可見,β-catenin在細胞核內(nèi)的累積(nuclear accumulation)是經(jīng)典Wnt信號通路激活的關鍵事件之一。然而,有關β-catenin核內(nèi)累積的分子調(diào)控機制迄今仍知之甚少。LisH2 (Lisl Homology 2)是一個進化上高度保守的蛋白,早期研究顯示其在細胞質(zhì)與細胞核中均有定位,能夠與RanBPM (Ran-binding protein M)蛋白相互作用。RanBPM作為支架蛋白,在細胞信號轉(zhuǎn)導通路和細胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要功能。但是關于LisH2的生化特性及其生物學功能至今仍不清楚。在本研究中,為深入了解LisH2的生物學功能及其與人類疾病的相關性,我們首先在TCGA (The Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫中進行生物信息學分析,結(jié)果顯示LisH2 mRNA在結(jié)直腸癌組織中表達明顯上調(diào),小規(guī)模的臨床樣本研究也證實LisH2 mRNA和蛋白水平的確在結(jié)直腸癌組織中上升,提示LisH2可能參與結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展過程。由于多條細胞信號通路異常與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關,我們通過一系列監(jiān)測細胞信號通路活性的報告基因?qū)嶒?發(fā)現(xiàn)下調(diào)LisH2可特異性地抑制Wnt信號通路報告基因的活性。而且,下調(diào)LisH2顯著抑制Wnt信號誘導的靶基因Axin2和CyclinDl的表達。這些結(jié)果表明LisH2可能是經(jīng)典Wnt信號通路中一個正向的調(diào)節(jié)因子。為了闡明LisH2調(diào)節(jié)經(jīng)典Wnt信號通路的分子機制,我們首先檢測了該通路的關鍵分子β-catenin的水平。我們發(fā)現(xiàn)下調(diào)LisH2對β-catenin總體蛋白水平并沒有明顯的影響,但是卻顯著抑制β-catenin在細胞核中的水平。免疫熒光實驗進一步證實降低LisH2表達減弱β-catenin在細胞核中的定位。在LisH2表達下調(diào)的細胞中,與細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子TCF4結(jié)合的β-catenin含量也明顯降低。此外,我們發(fā)現(xiàn)LisH2同β-catenin類似,也受到Axin復合物的調(diào)控,Wnt信號能夠通過抑制Axin復合物增強LisH2穩(wěn)定和核內(nèi)累積。以上結(jié)果表明LisH2通過促進β-catenin在細胞核中的累積,參與調(diào)控經(jīng)典Wnt信號通路。為了探索LisH2調(diào)控β-catenin核內(nèi)累積的分子機制,我們檢測了LisH2與β-catenin的相互作用。GST沉降和免疫共沉淀實驗顯示LisH2通過其CRA結(jié)構(gòu)域與β-catenin直接結(jié)合。外源表達野生型LisH2以及缺失LisH或CTLH結(jié)構(gòu)域的LisH2突變體都能夠成功挽救LisH2下調(diào)造成的表型,但缺失CRA結(jié)構(gòu)域的LisH2突變體卻無法挽救。進一步在細胞內(nèi)過表達帶有核定位序列的LisH2及其突變體,我們發(fā)現(xiàn)即使在Wnt信號未激活的條件下,促進LisH2的核內(nèi)定位足以提高β-catenin在細胞核中的累積,但唯獨缺失CRA結(jié)構(gòu)域的LisH2突變體無此功能。這些結(jié)果表明LisH2通過CRA結(jié)構(gòu)域與β-catenin結(jié)合,幫助其在細胞核內(nèi)定位。為了研究LisH2調(diào)節(jié)經(jīng)典Wnt信號通路的生理意義,我們在常用于經(jīng)典Wnt信號通路研究的模式生物斑馬魚中進行實驗。借助體視顯微鏡對胚胎發(fā)育形態(tài)的觀察,以及原位雜交實驗檢測背腹體軸分子標記和Wnt靶基因的表達情況,我們發(fā)現(xiàn)下調(diào)LisH2導致胚胎發(fā)育出現(xiàn)腹部化,與β-catenin功能缺失造成的表型相類似。外源表達野生型LisH2或帶有核定位序列的β-catenin均能挽救腹部化表型,但缺失CRA結(jié)構(gòu)域的LisH2突變體不能挽救。以上結(jié)果表明LisH2通過促進β-catenin核內(nèi)累積而影響經(jīng)典Wnt信號通路,參與調(diào)控斑馬魚胚胎背腹體軸的發(fā)育。由于Wnt信號異�；罨墙Y(jié)直腸癌發(fā)生和發(fā)展的重要原因之一,而我們發(fā)現(xiàn)LisH2在結(jié)直腸癌組織中高表達,因此我們進一步探索LisH2在結(jié)直腸癌發(fā)生和發(fā)展中的作用。在APC基因突變的結(jié)直腸癌細胞系DLDl和SW480中,敲低LisH2可有效下調(diào)核內(nèi)β-catenin的水平。下調(diào)LisH2不僅降低Wnt報告基因活性和靶基因的表達,而且還抑制了癌細胞的增殖、生長和成瘤能力。這些研究表明LisH2可能通過促進β-catenin核內(nèi)累積而影響經(jīng)典Wnt信號通路,參與調(diào)控結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展。綜合上述研究結(jié)果,LisH2可能通過促進β-catenin在細胞核中的累積,參與調(diào)節(jié)經(jīng)典Wnt信號通路,進而調(diào)控胚胎早期背腹體軸發(fā)育以及結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展。這一研究有助于我們深入了解LisH2的生物學功能和經(jīng)典Wnt信號通路的分子調(diào)控機理,為與該信號通路異常相關的人類疾病提供新的潛在治療靶點。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R363

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