發(fā)布時間：2018-02-08 21:23

  本文關鍵詞： 白介素-1β MRP1轉運體 SNARF1染料 脂多糖　出處：《浙江大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：細胞因子風暴(cytokine storm)是機體多種細胞因子如白介素-1β(IL-1β)、IL-6和γ-干擾素(IFN-γ)等迅速大量產(chǎn)生的現(xiàn)象,可引發(fā)多器官衰竭。其中,IL-1β是一種非常重要的促炎性細胞因子。在多種炎性疾病例如家族性地中海熱、家族性寒冷型自身炎癥綜合征、先天性多系統(tǒng)炎性疾病和高免疫球蛋白D綜合征,以及髓性白血病中IL-1p分泌升高。對IL-1β的分泌機制進行深入研究,對于臨床如何控制細胞因子風暴將具有重要的指導意義。關于IL-1β的分泌,目前所知有限。IL-1β有兩種形式：首先在胞漿內以無活性的proIL-1β形式(31kDa)被翻譯出來,然后被caspase-1剪切成有活性的matureIL-1β(17kDa)并分泌到胞外。前人的研究已經(jīng)證實IL-1β缺乏信號肽,無法通過內質網(wǎng)-高爾基體經(jīng)典分泌途徑分泌到胞外。細胞免疫熒光染色顯示IL-1β均勻分布在細胞漿中,我們推測胞膜上的廣泛存在的各類轉運體(transporters)是IL-1p的主要分泌途徑。本研究的主要目的是篩選與IL-1p分泌相關的轉運體,并對相關分泌機制進行較為深入的研究。方法1白介素-1β在單核、巨噬及中性粒細胞中分泌檢測1.1獲取人源性和鼠源性的單核細胞、巨噬細胞和中性粒細胞獲取人外周血原代單核細胞、巨噬細胞和中性粒細胞；使用丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)分化THP-1細胞得到人源性巨噬細胞；獲取小鼠腹腔和骨髓巨噬細胞；培養(yǎng)小鼠巨噬細胞株RAW 264.7和J774A.1細胞；獲取小鼠腹腔和骨髓中性粒細胞；培養(yǎng)和分化HL60細胞成為人源性中性粒細胞。使用Wright-Giemsa染色和流式細胞術檢測獲取的細胞純度。1.2 IL-1β檢測使用1μg/ml LPS 4h和/或ATP1mM 45min進行細胞刺激,設置三組：無處理細胞組(Untreated cells, UT), LPS單刺激組(L), LPS+ATP雙單刺激組(LA)。使用ELISA, Western Blotting和細胞免疫熒光法進行上清IL-1p以及胞漿內IL-1p檢測。2篩選白介素-1p分泌相關的轉運體2.1篩選可抑制IL-1β分泌的轉運體在人外周血原代巨噬細胞、THP-1細胞分化來源巨噬細胞和FVB wild type (FVBwt)小鼠腹腔巨噬細胞中,使用MRP1、BCRP、P-gp、OATP1B1和MATE轉運體抑制劑進行IL-1p分泌抑制實驗。2.2 MRPl轉運體功能驗證和表達檢測使用轉運體抑制劑處理細胞,將10μg/ml終濃度的SNARF1孵育細胞30分鐘后胞吐7小時,使用流式細胞儀檢測SNARF1胞漿內滯留程度驗證MRP1轉運體功能。使用流式細胞儀,Western Blotting和細胞免疫熒光法檢測MRP1蛋白的表達。2.3 MRPl基因敲除小鼠中IL-1p分泌檢測同性別、同年齡的FVBwt小鼠作為MRP1 Knock Out (MRP1ko)小鼠的陰性對照。培養(yǎng)FVBwt和MRP1ko 小鼠骨髓巨噬細胞,進行IL-1p分泌檢測。3阻滯白介素-1β與炎癥小鼠生存率的關系3.1腹膜炎小鼠造模調整LPS濃度,分別設置未處理組、1mg/kg組、1.5mg/kg組、2mg/kg組、5mg/kg組、10mg/kg組和50mg/kg組,每組1ml液體注射到小鼠腹腔中。3.2 MRP1腹膜炎小鼠體內細胞因子濃度檢測使用LPS lmg/kg腹腔注射小鼠,設置未處理組、刺激6小時組、刺激2天組、刺激6天組、刺激13天組和刺激27天組。獲取小鼠外周血和小鼠腹腔液的樣本,檢測以下32種細胞因子：Eotaxin、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1α、IL-1β、 IL-2、 IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、 IL-17、IP-10、KC、LIF、LIX、MCP-1、M-CSF、MIG、MIP-1α、 MIP-1β、MIP-2、 RANTES、TNF-α和VEGF。3.3小鼠生存率實驗使用FVBwt小鼠檢測LPS致死劑量,設置LPS 5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg和50mg/kg組進行濃度檢測。所有小鼠均注射LPS,然后用anakinra 745mg/kg或/和IL-18 BPd lmg/kg雙重拮抗IL-1p或/和IL-18,同時設置未注射任何拮抗劑組作為對照,觀察小鼠生存情況。4胞漿內白介素-1p谷胱甘肽化修-飾檢測使用BioGEE對胞內所有谷胱甘肽化的蛋白進行標記,裂解細胞。使用羊抗人IL-1β抗體通過免疫共沉淀pull-down細胞裂解液中的IL-1β蛋白,兔抗人IL-1p抗體Western Blotting驗證pull-down效果。使用streptavidin-HRP進行Western Blotting,檢測胞內IL-1β的谷胱甘肽化水平。結果1白介素-1β在單核、巨噬及中性粒細胞中分泌情況1.1成功獲取了各類人源性和鼠源性的單核細胞、巨噬細胞和中性粒細胞我們成功獲取人外周血原代單核細胞、巨噬細胞和中性粒細胞；使用PMA分化THP-1細胞得到了人源性巨噬細胞；獲取了小鼠腹腔和骨髓巨噬細胞；培養(yǎng)了小鼠巨噬細胞株RAW264.7和J774A.1細胞；獲取了小鼠腹腔和骨髓中性粒細胞；培養(yǎng)并分化HL60細胞成為人源性中性粒細胞。1.2 IL-1p分泌情況單核細胞和中性粒細胞僅需要LPS單刺激便可以分泌IL-1β,原代巨噬細胞需要LPS+ATP雙重刺激才可以分泌IL-1β。THP-1細胞株來源的人巨噬細胞分泌IL-1p的能力極為強大,上清中可同時見大量matureIL-1β和proIL-1β被分泌出來。THP-1分化來源的巨噬細胞、J774A.1細胞株和RAW264.7細胞株可以分泌proIL-1β.2抑制MRPl轉運體降低白介素-1β分泌2.1 MRP1轉運體可抑制IL-1β分泌MRP1、BCRP、P-gp、OATP1B1和MATE轉運體抑制劑發(fā)現(xiàn),抑制MRP1功能后IL-1β分泌顯著降低。2.2 MRP1轉運體功能正常并在細胞膜上分布SNARF1胞漿內滯留實驗表明MRP1轉運體抑制劑確實特異性地抑制MRP1轉運體功能。使用流式細胞術,Western Blotting和細胞免疫熒光法均在目標細胞中檢測MRP1蛋白的表達,MRP1轉運體分布在細胞膜上。2.3 MRP1基因敲除小鼠分泌matureIL-1β、能力降低在小鼠M0骨髓巨噬細胞中,MRPlko和FVBwt小鼠比較,MRPlko小鼠M0細胞分泌matureIL-1β能力低于FVBwt小鼠M0細胞,兩者呈顯著統(tǒng)計學差異(P=0.044)。3阻滯白介素-1p提高炎癥小鼠生存率3.1腹膜炎小鼠造模成功LPS 1mg/kg可以成功引發(fā)小鼠腹膜炎,這個劑量注射后的小鼠可以存活超過一個月。5mg/kg和10mg/kg屬于亞致死劑量,而50mg/kg屬于致死劑量�；加懈鼓ぱ椎男∈�,許多種類的炎癥因子都上升,包括IL-1β。3.2小鼠生存率實驗選取LPS 15mg/kg用于小鼠生存率檢查。與未拮抗的對照組比較,anakinra 745mg/kg拮抗組、anakinra 745mg/kg和IL-18 BPd lmg/kg雙重拮抗組均能改善小鼠生存率。因小鼠樣本過少,組間數(shù)據(jù)比較未能得到顯著性差異。4胞漿內IL-1p可被谷胱甘肽化修飾兔抗人IL-1β抗體的Western Blotting結果表明目標蛋白已被成功pull down, streptavidin-HRP抗體的Western Blotting結果表明胞內IL-1p被谷胱甘肽化。結論(1)單核細胞、中性粒細胞僅需要LPS單刺激便可以分泌matureIL-1β,巨噬細胞需要LPS+ATP雙重刺激才可以分泌matureIL-1β。THP-1分化的人源巨噬細胞、小鼠巨噬細胞株J774A.1細胞和RAW264.7細胞可以分泌proIL-1β。(2)MRP1轉運體分布在細胞膜上,是matureIL-1β的分泌通路之一。(3)炎癥狀態(tài)下,matureIL-1β分泌增多。對matureIL-1β進行阻滯,可提高炎癥小鼠的生存率。(4)細胞內IL-1p可被谷胱甘肽化修飾。谷胱甘肽化修飾后的蛋白是MRP1轉運體的運輸?shù)孜�。MRP1轉運體可能通過谷胱甘肽化修飾調節(jié)IL-1β的分泌
[Abstract]:......
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R363

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本文編號：1496303