本文關(guān)鍵詞： 腎素原受體 腎臟 局部腎素-血管緊張素系統(tǒng) 果糖 高血壓 電解質(zhì)平衡　出處：《中山大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景腎素原受體((Pro)renin receptor,PRR)首次由Nguyen等發(fā)現(xiàn),它與腎素結(jié)合而增強(qiáng)腎素活性,與腎素原結(jié)合而促進(jìn)腎素原通過構(gòu)象變化而非蛋白酶酶解活化。PRR作為一個(gè)組織特異性基因,不直接通過循環(huán)系統(tǒng)發(fā)揮作用,而是作為組織局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system,RAS)的調(diào)節(jié)因子來發(fā)揮其功能。眾多研究顯示PRR在腎臟血管、近端小管、遠(yuǎn)端小管(Distal convoluted tubule,DCT)、連接小管和集合管等都有表達(dá),存在3種不同的分子形式:全長(zhǎng)的PRR(full-length PRR,f PRR)、可溶性的PRR(soluble PRR,s PRR)和M8.9(8.9k Da)。盡管目前有很多報(bào)道傾向于認(rèn)為PRR調(diào)節(jié)液泡型H~+-ATP水解酶和Wnt/β-catenin信號(hào)通路,但是也有越來越多的證據(jù)說明腎臟和大腦組織等局部PRR的腎素調(diào)節(jié)功能。小鼠全身性PRR敲除是致死的,而對(duì)于PRR的抑制劑,目前有腎素原前段柄區(qū)肽(Handle Region Peptide,HRP,R10ILLKKMPSV19)和腎素原前段20個(gè)氨基酸多肽(the first 20 amino acid residues of the prorenin prosegment,PRO20,L1PTDTASFGRILLKKMPSVR20)兩種,與HRP相比,PRO20是最新設(shè)計(jì)的,它能夠有效地抑制局部RAS的活化以及Ang II和DOCA鹽誘導(dǎo)的高血壓的發(fā)生發(fā)展。鈉(Sodium,Na~+)和鉀(Potassium,K~+)是細(xì)胞內(nèi)主要的陽離子,維持它們?cè)隗w內(nèi)平衡對(duì)生物體的生存至關(guān)重要。醛固酮被認(rèn)為是調(diào)節(jié)體內(nèi)電解質(zhì)平衡的重要因子,過表達(dá)人PRR基因的大鼠分泌醛固酮增加,這提示PRR對(duì)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin angiotensin aldosterone system,RAAS)具有調(diào)節(jié)作用。低鹽或高鹽處理都能促進(jìn)腎臟PRR的表達(dá),這與醛固酮分泌的變化相一致。研究還發(fā)現(xiàn)腎臟PRR可調(diào)節(jié)上皮鈉通道(epithelial Na~+channel,ENa C)的表達(dá)及活性,這些結(jié)果進(jìn)一步暗示了腎臟PRR在電解質(zhì)代謝平衡中具有潛在的調(diào)節(jié)作用。研究目標(biāo)基于以上背景,本研究,我們擬利用影響電解質(zhì)平衡的高果糖模型和高鉀模型,通過探討高果糖/高鉀對(duì)腎臟PRR表達(dá)及RAS的影響,以及觀察腎臟PRR在腎內(nèi)RAS活化和Na~+、K~+平衡調(diào)控中的作用,揭示腎臟PRR在腎臟RAS中的作用及其對(duì)電解質(zhì)平衡調(diào)控的可能的分子機(jī)制。研究方法第一部分:腎素原受體對(duì)果糖誘導(dǎo)的鹽敏感性高血壓的調(diào)控作用及其機(jī)制(1)用20%果糖飲水處理SD大鼠,利用蛋白印跡(western blotting,WB)實(shí)驗(yàn)及逆轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR)檢測(cè)腎臟PRR的表達(dá),利用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)血漿和尿液s PRR的水平。(2)用PRO20皮下注射干預(yù)20%果糖飲水處理的SD大鼠,利用ELISA方法檢測(cè)血漿和尿液Ang II、醛固酮、腎素活性及腎素含量,利用WB和RT-q PCR方法檢測(cè)腎臟強(qiáng)鈉氫交換子3(sodium/hydrogen exchanger 3,NHE3)和鈉鉀氯共轉(zhuǎn)運(yùn)體(Na/K/2Cl cotransporter,NKCC2)的表達(dá)情況,利用呋塞米速尿?qū)嶒?yàn)檢測(cè)NKCC2的體內(nèi)活性,分析血漿及尿液的Na~+、K~+、Cl-及滲透壓水平。(3)用PRO20皮下注射干預(yù)20%果糖飲水處理的SD大鼠,同時(shí)給予8%高鹽進(jìn)食并遙測(cè)法檢測(cè)血壓2周。(4)用別嘌呤醇干預(yù)20%果糖飲水處理的SD大鼠,利用ELISA方法檢測(cè)血漿和尿液尿酸(uric acid,UA)、s PRR、Ang II、醛固酮、腎素活性及腎素含量,利用WB和RT-q PCR方法檢測(cè)腎臟PRR、Renin、NHE3和NKCC2的表達(dá)情況,利用呋塞米速尿?qū)嶒?yàn)檢測(cè)NKCC2的體內(nèi)活性,分析血漿及尿液的Na~+、K~+、Cl-及滲透壓水平。(5)用別嘌呤醇干預(yù)20%果糖飲水處理的SD大鼠,同時(shí)給予8%高鹽進(jìn)食并遙測(cè)法檢測(cè)血壓2周。(6)體外應(yīng)用人腎近曲小管上皮細(xì)胞(Human renal proximal tubule epithelial cells,HK2),用高果糖處理,用別嘌呤醇干預(yù),WB檢測(cè)細(xì)胞PRR蛋白的表達(dá),ELISA檢測(cè)培養(yǎng)基中s PRR水平。第二部分:腎素原受體對(duì)鉀平衡的調(diào)控作用及其機(jī)制(1)用5%K~+鼠糧(92 g正常鼠糧~+8 g KCl)處理正常SD大鼠,利用WB實(shí)驗(yàn)及RT-q PCR檢測(cè)腎臟PRR的表達(dá),ELISA檢測(cè)血漿和尿液s PRR、醛固酮的水平。(2)用5%K~+鼠糧處理正常SD大鼠,同時(shí)皮下注射PRO20,利用ELISA方法檢測(cè)血漿和尿液醛固酮、腎素活性及腎素含量,利用WB方法檢測(cè)腎臟細(xì)胞色素P450家族11-B亞族-多肽2(Cytochrome P450,family 11,subfamily B,polypeptide 2,CYP11B2)、ENa C、鈉氯共轉(zhuǎn)運(yùn)體(Na~+-Cl-cotransporter,NCC)、腎外髓鉀通道(Renal outer medullary K~+channel,ROMK)、大電導(dǎo)、鈣活化的鉀通道(Large-conductance Calcium-activated K~+channel,BK)和α-鈉-鉀-ATP酶(Alpha Na~+-K~+-ATPase,α-NKA)的表達(dá)情況,免疫熒光方法檢測(cè)NCC在DCT的表達(dá)情況,同時(shí)分析血漿及尿液的Na~+、K~+和Cl-水平。(3)為了進(jìn)一步確定腎臟PRR對(duì)腎性醛固酮的合成及K~+平衡的調(diào)控作用,我們切除大鼠雙側(cè)腎上腺,用5%K~+鼠糧處理,并通過腎內(nèi)灌注PRO20,同樣分析腎臟PRR、CYP11B2、ENa C、NCC、ROMK、BK和α-NKA的表達(dá),分析血漿和尿液的電解質(zhì)、s PRR、醛固酮及腎素水平。(4)為了進(jìn)一步確定腎性醛固酮的存在,我們利用雙側(cè)腎上腺切除大鼠,用5%K~+鼠糧處理,并通過口服螺內(nèi)酯,分析血漿及尿液的電解質(zhì)和醛固酮水平,分析腎臟PRR、CYP11B2、ENa C、NCC、ROMK、BK和α-NKA的表達(dá)水平。(5)腎臟集合管是腎臟調(diào)節(jié)K~+平衡的重要結(jié)構(gòu),因此,我們還利用原代培養(yǎng)的大鼠內(nèi)髓集合管(inner medullary collecting duct,IMCD)細(xì)胞,用高鉀處理,用PRO20或PRR si RNA干預(yù),WB檢測(cè)細(xì)胞PRR及CYP11B2蛋白的表達(dá),ELISA檢測(cè)培養(yǎng)基中s PRR、醛固酮及腎素水平。研究結(jié)果第一部分:腎素原受體對(duì)果糖誘導(dǎo)的鹽敏感性高血壓的調(diào)控作用及其機(jī)制(1)我們發(fā)現(xiàn)20%果糖飲水促進(jìn)腎臟f PRR和s PRR蛋白及PRR m RNA的表達(dá),增加尿s PRR的排泄以及血漿s PRR的濃度。(2)20%果糖飲水增加尿液Ang II和醛固酮的排泄,升高尿液腎素活性和腎素含量,升高腎臟NHE3和NKCC2蛋白及m RNA的表達(dá)水平,增強(qiáng)大鼠對(duì)呋塞米的速尿反應(yīng),以上這些變化均被PRO20皮下注射所逆轉(zhuǎn),但不影響血漿Ang II、醛固酮、腎素活性及腎素含量。(3)單獨(dú)20%果糖飲水不會(huì)引起血壓升高,在同時(shí)給予8%高鹽進(jìn)食時(shí),血壓高約升10 mm Hg,并且被PRO20完全阻斷。(4)用別嘌呤醇抑制果糖代謝引起的腎臟內(nèi)源性UA的升高,完全阻斷了果糖對(duì)尿液Ang II和醛固酮排泄、尿液腎素活性和腎素含量、腎臟NHE3和NKCC2蛋白及m RNA的表達(dá)水平以及大鼠對(duì)呋塞米的速尿反應(yīng)的刺激作用,但不影響血漿Ang II、醛固酮、腎素活性及腎素含量。(5)別嘌呤醇完全阻斷了高果糖誘導(dǎo)的鹽敏感性高血壓。(6)體外HK2細(xì)胞實(shí)驗(yàn),果糖促進(jìn)細(xì)胞f PRR和s PRR蛋白的表達(dá)以及培養(yǎng)基s PRR的分泌,并且具有時(shí)間和劑量依賴性,并且完全被別嘌呤醇處理所抑制。第二部分:腎素原受體對(duì)鉀平衡的調(diào)控作用及其機(jī)制(1)我們發(fā)現(xiàn)大鼠高鉀進(jìn)食顯著升高腎臟f PRR的蛋白表達(dá)水平、24 h尿s PRR排泄,而降低血漿s PRR濃度,但對(duì)腎臟PRR m RNA的表達(dá)水平?jīng)]有影響。(2)利用正常大鼠實(shí)驗(yàn),皮下注射PRO20,顯著抑制高鉀誘導(dǎo)的尿液腎素活性及腎臟CYP11B2、ENa C、NCC、ROMK、BK和α-NKA的蛋白表達(dá),進(jìn)一步升高血鉀濃度,降低尿鈉、鉀和醛固酮的排泄。(3)利用雙側(cè)腎上腺切除大鼠實(shí)驗(yàn),腎內(nèi)灌注PRO20,同樣可以觀察到顯著抑制高鉀引起的尿液腎素活性及醛固酮的升高,降低腎臟CYP11B2、ENa C、NCC、ROMK、BK和α-NKA的蛋白表達(dá),而對(duì)f PRR的蛋白表達(dá)及尿s PRR沒有影響,也發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步升高血鉀濃度,抑制尿鈉、鉀的排泄。(4)利用雙側(cè)腎上腺切除大鼠實(shí)驗(yàn),同時(shí)口服螺內(nèi)酯,螺內(nèi)酯進(jìn)一步增加高鉀進(jìn)食引起的血鉀濃度的升高和尿鈉排泄,而減低尿鉀排泄和血鈉濃度,而不影響尿醛固酮的排泄,同時(shí)也降低高鉀引起的腎臟ENa C、ROMK、BK和α-NKA的蛋白表達(dá)。(5)體外原代培養(yǎng)的IMC D細(xì)胞,K~+而非Cl-處理促進(jìn)細(xì)胞f PRR和CYP11B2蛋白的表達(dá)及醛固酮的合成與分泌。PRO20或PRR si RNA處理,顯著抑制CYP11B2蛋白的表達(dá)及培養(yǎng)基醛固酮含量和腎素活性。s PRR和腎素原可直接刺激IMCD細(xì)胞表達(dá)CYP11B2和分泌醛固酮,敲除PRR后顯著抑制腎素原的作用。研究結(jié)論通過本研究,我們得出以下結(jié)論:(1)高果糖通過代謝產(chǎn)生UA刺激腎臟PRR的表達(dá),激活腎內(nèi)RAS,從而調(diào)節(jié)腎臟NHE3和NKCC2的表達(dá)與活性,調(diào)節(jié)腎臟對(duì)Na~+的重吸收,調(diào)節(jié)果糖誘導(dǎo)的鹽敏感性高血壓的發(fā)生發(fā)展;(2)高鉀促進(jìn)腎臟PRR的表達(dá),活化腎內(nèi)RAAS,促進(jìn)腎臟CYP11B2的表達(dá),從而促進(jìn)腎臟合成和分泌醛固酮,進(jìn)而調(diào)節(jié)腎臟ENa C、NCC、ROMK、BK和α-NKA的表達(dá),調(diào)節(jié)K~+分泌與排泄。這一研究進(jìn)一步揭示了腎臟局部RAS的功能和調(diào)節(jié)機(jī)制,以及腎臟PRR在電解質(zhì)平衡過程中的調(diào)控作用和機(jī)制,并為此提供了新的視角。
[Abstract]:The research background renin receptor ( PRR ) was first discovered by Nguyen et al . , which enhanced the renin activity by the combination of renin with renin . PRR , as a tissue - specific gene , does not function directly through the circulatory system , but it has three different molecular forms : full - length PRR ( f PRR ) , soluble PRR ( s PRR ) and M8 . 9 ( 8.9k Da ) . 灝界鐩墠鏈夊緢澶氭姤閬撳，

本文編號(hào)：1499099