發(fā)布時(shí)間：2018-01-16 01:18

  本文關(guān)鍵詞：抑制PGC-1α的表達(dá)對(duì)PD模型小鼠炎癥反應(yīng)的影響　出處：《河北師范大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：帕金森病(PD)是繼阿爾茨海默病之后的第二種最常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,也是中老年中發(fā)病率較高的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。PD的主要特征表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)遲緩、僵硬、震顫和姿勢(shì)不穩(wěn)定性。雖然這些癥狀已經(jīng)是PD的經(jīng)典描述,但最近其被公認(rèn)為是一個(gè)更加復(fù)雜的疾病,包括運(yùn)動(dòng)癥狀和非運(yùn)動(dòng)癥狀(NMS),如抑郁癥、睡眠障礙、感覺(jué)異常、植物神經(jīng)功能紊亂和認(rèn)知能力的下降。研究發(fā)現(xiàn),與PD發(fā)生密切的因素主要有線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、α-突觸核蛋白基因突變等遺傳因素、環(huán)境因素、炎癥反應(yīng)等,但具體發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。在上述眾多因素中,線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激反應(yīng)是引發(fā)PD的主要因素。線粒體是生命個(gè)體中直接提供能量的細(xì)胞器,其在維持神經(jīng)元正常功能上起到非常重要的作用。線粒體復(fù)合物Ⅰ(mitochondrial complexⅠ)是線粒體呼吸鏈中最大的復(fù)合體,是線粒體發(fā)揮氧化磷酸化功能的關(guān)鍵。其異�？梢砸鸹钚匝踝杂苫�(reactive oxygen species,ROS)生成增多,從而引發(fā)細(xì)胞損傷,乃至死亡。除此之外,膠質(zhì)細(xì)胞誘發(fā)的炎癥反應(yīng)對(duì)PD的影響逐漸成為研究的熱點(diǎn)。在正常情況下,膠質(zhì)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)。當(dāng)神經(jīng)元損傷導(dǎo)致免疫原性分子釋放時(shí),膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)變形形態(tài),并顯示出相應(yīng)的活化表型。神經(jīng)炎癥最顯著的特點(diǎn)是小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活與增生。膠質(zhì)細(xì)胞的激活可以產(chǎn)生大量有害的活性氧(ROS)和活性氮(RNS),與此同時(shí),還可以分泌大量促炎細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6和干擾素γ(IFN-γ),結(jié)合神經(jīng)元受體從而啟動(dòng)細(xì)胞的死亡途徑。近年來(lái),有多種生理功能活性的過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)的共激活因子1α(PGC-1α)受到越來(lái)越多的關(guān)注。其功能除了對(duì)線粒體的生物發(fā)生及代謝過(guò)程起到非常重要的作用外,還發(fā)現(xiàn)PGC-1α有抑制炎癥反應(yīng)的作用,其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路來(lái)抑制膠質(zhì)細(xì)胞的激活與增生而抑制炎癥反應(yīng)的過(guò)程,從而對(duì)神經(jīng)元起到保護(hù)作用。但在PD發(fā)生過(guò)程中,PGC-1α起到何種作用?其表達(dá)的變化與炎癥反應(yīng)和PD發(fā)生之間是何種關(guān)系?這是一個(gè)值得深入探討的問(wèn)題。本研究擬通過(guò)降低PGC-1α的表達(dá),觀察其表達(dá)情況與炎癥反應(yīng)之間關(guān)系、是否對(duì)神經(jīng)元起到保護(hù)作用、以及是否可以改善PD小鼠的癥狀等對(duì)上述問(wèn)題進(jìn)行探討。本研究以C57BL/6小鼠為對(duì)象,用立體定位注射方法將構(gòu)建的抑制PGC-1α表達(dá)的慢病毒載體注射至小鼠的一側(cè)黑質(zhì),飼養(yǎng)28 d后,再通過(guò)腹腔注射MPTP的方法復(fù)制PD小鼠亞急性模型。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組(立體定位saline,腹腔注射saline,記為saline+saline組)、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(立體定位saline,腹腔注射MPTP 30 mg/kg,記為MPTP+saline組)、實(shí)驗(yàn)空載組(立體定位空載慢病毒載體NCKD,腹腔注射MPTP,記為MPTP+NCKD組)、實(shí)驗(yàn)組(立體定位抑制PGC-1α表達(dá)的慢病毒載體,腹腔注射MPTP,記為MPTP+KD組)。采用行為學(xué)方法檢測(cè)帕金森癥狀;免疫熒光染色方法檢測(cè)黑質(zhì)內(nèi)TH、PGC-1α等陽(yáng)性細(xì)胞,以及小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物Iba1(ionized calcium-binding adapter molecule 1,Iba1)的數(shù)量和星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP(Glial Fiber Acid Protein,GFAP)的累積光密度;FJC染色法檢測(cè)凋亡細(xì)胞的數(shù)量;Western blot技術(shù)檢測(cè)TH、PGC-1α蛋白在黑質(zhì)內(nèi)的表達(dá)情況,以探究抑制PGC-1α的表達(dá)對(duì)PD小鼠行為癥狀,以及炎癥反應(yīng)相關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖情況的影響,揭示PGC-1α、炎癥和PD之間的關(guān)系。所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1.用腹腔注射MPTP(30 mg/kg)的方法成功復(fù)制出PD小鼠模型。并隨著MPTP注射天數(shù)的增加,存活的多巴胺能神經(jīng)元、PGC-1α陽(yáng)性細(xì)胞逐漸減少,凋亡細(xì)胞數(shù)逐漸增加;TH、PGC-1α蛋白表達(dá)量越來(lái)越少;炎癥反應(yīng)越來(lái)越重,最終確定MPTP最佳損傷時(shí)間窗為3 d。2.成功構(gòu)建了抑制PGC-1α表達(dá)的慢病毒載體,用q PCR方法檢測(cè)出最佳干擾靶點(diǎn),通過(guò)熒光法測(cè)定出病毒的最佳滴度為5×108 TU/ml。3.MPTP+KD組黑質(zhì)DA能神經(jīng)元數(shù)量較MPTP+saline組顯著減少(P0.05);MPTP+KD組小鼠自主活動(dòng)及站立次數(shù)較MPTP+saline組呈下降趨勢(shì),而轉(zhuǎn)棒掉落次數(shù)以及游泳停頓時(shí)間較MPTP+saline組呈遞增趨勢(shì),但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。4.MPTP+KD組黑質(zhì)PGC-1α陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較MPTP+saline組顯著減少(P0.05),這表明立體定位注射抑制PGC-1α表達(dá)的慢病毒載體起到了減少PGC-1α表達(dá)的作用。5.定位注射抑制PGC-1α表達(dá)的慢病毒載體后,MPTP+KD組黑質(zhì)內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞以及星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)量較MPTP+saline組顯著降低(P0.05)。提示炎癥反應(yīng)降低。通過(guò)上述結(jié)果的分析,得出如下結(jié)論:1.通過(guò)炎癥與DA神經(jīng)元的存活與凋亡確定了MPTP最佳損傷時(shí)間窗為3 d。2.篩選出抑制PGC-1α表達(dá)的慢病毒載體,病毒滴度為5×108 TU/ml。3.抑制PGC-1α的表達(dá),顯著減少黑質(zhì)DA能神經(jīng)元存活數(shù)量、增多其凋亡,同時(shí)也降低小膠質(zhì)細(xì)胞以及星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活程度。上述結(jié)果表明,抑制PGC-1α的表達(dá),可通過(guò)影響小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性而降低炎癥反應(yīng)。本研究為防治帕金森氏病提供了基礎(chǔ)資料,但相關(guān)的機(jī)制還有待于后繼的進(jìn)一步研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R742.5;R-332

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本文編號(hào)：1430916