本文關(guān)鍵詞：抑制糖原合成酶激酶3β誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及其對組織損傷的保護作用　出處：《南京大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：研究目的： 了解抑制GSK3β對體外誘導(dǎo)分化M1型Mψψ表型的影響及機制并探討GSK3β抑制劑(TDZD-8)對葉酸腎損傷模型小鼠腎臟Mψψ表型的影響和腎臟損傷的保護作用。研究方法：體外培養(yǎng)骨髓細(xì)胞,在脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)和Y-干擾素(intertferon-gamma, IFNy)作用下轉(zhuǎn)化為M1型Mψψ。分別使用不同濃度糖原合成酶激酶3β (glycogen synthase kinase 3β, GSK3β)抑制劑TDZD-8(0,1,2.5,5μM)和氯化鋰(Lithium Choloride, LiCl)、SiRNA干擾技術(shù)抑制GSK3β,通過免疫熒光、蛋白印跡以及流式細(xì)胞等方法檢測Mψψ表面標(biāo)志物如M1標(biāo)志物誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)和白介素-1β (interleukin-1 beta,IL-1p)和M2標(biāo)志物精氨酸酶I (arginase I, Arg I)和甘露糖受體(mannose receptor, MR)表達的變化情況,以及該過程中細(xì)胞信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducers and activators of transcription, STAT)以及過氧化物酶體增殖物激活受體γ (peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR-γ)活性的變化。并通過使用相應(yīng)STAT、PPARγ的激活劑／抑制劑探討GSK3β抑制劑誘導(dǎo)Mψψ表型變化的潛在機制。在急性腎損傷葉酸動物模型中應(yīng)用GSK3β抑制劑TDZD-8,采用前處理(TDZD-pre,葉酸注射前30分鐘單次給藥)和后處理(TDZD-post,在葉酸注射后第5天單次給藥),觀察各組小鼠腎功能指標(biāo)變化情況,并在第7天觀察腎臟損傷以及組織內(nèi)Mψψ的表型,以及在第28天時腎臟組織纖維化的程度。研究結(jié)果： 體外研究發(fā)現(xiàn),骨髓細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)分化的Ml型Mψψ在不同濃度TDZD-8作用48小時后,細(xì)胞表達iNOS和IL-1β顯著下降,而ArgI和MR受體表達顯著上升,這種作用在TDZD-80-5μM濃度區(qū)間呈劑量依賴。免疫熒光檢測顯示在TDZD-8作用下,M1型Mψψ表達iNOS顯著下降,流式細(xì)胞儀檢測表明TDZD-8使M1型Mψψ表達MR顯著上升。使用SiRNA干擾技術(shù)發(fā)敲低GSK3β表達后M1型Mφ表達ArgⅠ和MR顯著上升。M1型Mφ在5μM TDZD-8干預(yù)下,細(xì)胞pSTAT1, pSTAT6的表達在120分鐘內(nèi)無顯著變化,pSTAT3的表達呈時間依賴下降。 使用STAT3特異性抑制劑(stattic)對M1型Mφ進行干預(yù),M1型Mφ表達M2標(biāo)志物(ArgⅠ和MR)無顯著上調(diào)。M1型Mφ在TDZD-8干預(yù)下,細(xì)胞抑制性磷酸化PPARy (pPPARy)表達顯著下調(diào)。使用PPARy抑制劑(GW6229)和TDZD-8對M1型Mφ共處理后,TDZD-8誘導(dǎo)的M2標(biāo)志物(ArgⅠ和MR)表達的上調(diào)能被顯著抑制。體內(nèi)對葉酸腎損傷模型的研究發(fā)現(xiàn),在損傷早期,小鼠腎臟小管間質(zhì)呈現(xiàn)典型的急性腎損傷的特點,血清肌酐(serum creatinine, Scr)顯著上升。急性期過后,盡管Scr逐漸下降,但腎臟組織逐漸出現(xiàn)慢性化病變,在28天后腎臟組織有明顯的膠原Ⅰ和纖維連接蛋白沉積。在損傷前預(yù)防性給予(前處理)或在損傷后第5天給予(后處理)TDZD-8均可顯著減輕第7天時腎臟的損傷,并減輕第28天時腎臟的纖維化。前處理后腎臟組織中細(xì)胞凋亡(TUNEL)顯著減少,細(xì)胞增生、修復(fù)(Ki-67, PAX 2)等指標(biāo)表達顯著上升,組織中M2型Mφ比例無顯著上調(diào)(TDZD-pre:FA:26.8±12.4 vs 17.4±5.7, P0.05)。后處理中,組織也表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡(TUNEL)的減少,細(xì)胞增生、修復(fù)(Ki-67, PAX 2)等指標(biāo)表達的上調(diào),但程度顯著弱于前處理組(P0.05)。后處理中組織中M2型Mφ比例顯著高于前處理組(TDZD-pre:TDZD-post:26.8±12.4 vs 85.7±9.3, P0.01)。研究結(jié)論：抑制GSK3β可誘導(dǎo)M1型Mφ向M2轉(zhuǎn)化。后處理中使用GSK3β抑制劑TDZD-8具有誘導(dǎo)葉酸腎臟損傷模型腎臟組中Mφ向M2轉(zhuǎn)化的作用,并減輕腎臟的纖維化,這一作用至少部分依賴于PPAR-γ通路實現(xiàn)。以上結(jié)果提示,GSK3β可作為潛在急性腎損傷的干預(yù)靶點改善腎臟的遠(yuǎn)期預(yù)后。
[Abstract]:Objective: To investigate the effect of inhibition of GSK3 beta on in vitro differentiation of M1 type M psi psi phenotype, and to explore the mechanism of GSK3 beta inhibitor (TDZD-8) protective effect of folic acid effect on renal injury model of mouse kidney M psi psi phenotype and kidney injury. Methods: bone marrow cells were cultured in vitro and in lipopolysaccharide (Lipopolysaccharide, LPS) interferon and Y- (intertferon-gamma, IFNy) under the action of transformation to M1 M psi. Psi respectively with different concentrations of glycogen synthase kinase 3 beta (glycogen synthase kinase GSK3 3 beta, beta) inhibitor TDZD-8 (0,1,2.5,5 M) and lithium chloride (Lithium Choloride, LiCl), the inhibition of GSK3 beta SiRNA interference by immunofluorescence, Western blot and flow cytometry assay M psi psi surface markers such as M1 markers of inducible nitric oxide synthase (iNOS inducible nitric oxide synthase) and interleukin -1 beta (interleukin-1 beta, IL-1p and M2) Markers of arginase I (arginase I, Arg I) and mannose receptor (mannose receptor, MR) expression changes, and the process of cell signal transducer and activator of transcription (signal transducers and activators of transcription, STAT) and the peroxidase proliferator activated receptor gamma (peroxisome proliferator-activated receptor PPAR-, gamma) activity changes. And by using the corresponding STAT, PPAR gamma activator / inhibitor of GSK3 inhibitor M beta psi psi phenotypic changes induced by damage mechanism. Potential application of GSK3 beta inhibitor TDZD-8 in animal models of folic acid in acute kidney, before treatment using folic acid (TDZD-pre, 30 minutes before the injection of single dose (TDZD-post) and postprocessing, Fifth days after the injection of folic acid in single dose), observe the change of renal function in mice groups, and observe the renal injury and tissue M psi psi phenotype in seventh days, And the degree of renal fibrosis in twenty-eighth days. Results: in vitro, bone marrow cell culture and induced differentiation of Ml type M psi psi in 48 hours with different concentrations of TDZD-8, iNOS and IL-1 beta cell expression decreased significantly, while ArgI and MR receptor expression increased significantly, this effect was dose dependent in TDZD-80-5 M concentration range. Immunofluorescence staining results showed that in the presence of TDZD-8, M1 type M psi psi significantly decreased the expression of iNOS, flow cytometry showed that TDZD-8 type M1 M psi psi significantly increased expression of MR. Using SiRNA interference technology after knockdown of GSK3 expression of M1 type M with expression of Arg 1 and MR increased significantly.M1 M in 5 M TDZD-8 intervention, pSTAT1 cells, pSTAT6 expression did not change significantly in 120 minutes, the expression of pSTAT3 in a time dependent decrease. The use of STAT3 specific inhibitor (stattic) intervention on type M1 M type M1 M Phi Phi, the expression of M2 markers (Arg I and MR) no significant upregulation of.M1 M in TDZD-8 intervention, cell inhibitory phosphorylation of PPARy (pPPARy) expression was significantly reduced. The use of PPARy inhibitors (GW6229) and TDZD-8 of M1 M were treated with M2 markers, induced by TDZD-8 (Arg 1 and MR) can be significantly up-regulated study on folic acid suppression. Kidney injury model in vivo, in early injury, renal tubular interstitial characteristics of mice showed typical acute kidney injury, serum creatinine (serum creatinine, Scr) increased significantly. After the acute phase, while Scr decreased gradually, but the kidney tissue gradually appeared chronic lesions, obvious collagen and after 28 days of kidney tissue fibronectin deposition. Prophylactic administration in before injury (pretreatment) or in the fifth day after injury to kidney injury (postprocessing) of TDZD-8 can be significantly reduced by seventh days, and reduce renal fibrosis twenty-eighth days before treatment. Cell apoptosis in kidney tissue (TUNEL) significantly reduced cell proliferation and repair (Ki-67, PAX 2) index increased significantly, the M2 organization in M. There was no significant increase (TDZD-pre:FA:26.8 + 12.4 vs 17.4 + 5.7, P0.05). Postprocessing, tissue also showed cell apoptosis (TUNEL). Reduced cell proliferation and repair (Ki-67, PAX 2) were up-regulated, but significantly weaker than the pretreatment group (P0.05). M2 in postprocessing tissue M Phi ratio was significantly higher than before treatment group (TDZD-pre:TDZD-post:26.8 + 12.4 vs 85.7 + 9.3, P0.01). Conclusion: GSK3 can inhibit beta conversion to M2 induced M1 M phi. Postprocessing using the GSK3 beta inhibitor TDZD-8 can induce transformation of M to M2 with folic acid model of renal injury in the group of kidney function and relieve renal fibrosis, this effect is at least partly dependent on PPAR- gamma pathway. These results suggest that GSK3 can be used as a potential beta The intervention target of acute renal injury improves the long-term prognosis of kidney.

【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392

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