本文關(guān)鍵詞：4.1R基因缺失對IgE介導(dǎo)的肥大細(xì)胞活化的影響　出處：《鄭州大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 肥大細(xì)胞 4.1R 脫顆粒 FcεRI 組胺

【摘要】：研究背景肥大細(xì)胞來源于骨髓造血干細(xì)胞,其前體在定居的組織(皮膚、神經(jīng)周圍、腸粘膜、呼吸道粘膜等)器官中發(fā)育成熟。肥大細(xì)胞通過受體識別相關(guān)病原體,在機(jī)體抵抗病原微生物感染的固有免疫中發(fā)揮重要功能,其被活化后通過脫顆粒向周圍組織釋放組胺、細(xì)胞因子、趨化因子等炎性介質(zhì)參與I型變態(tài)反應(yīng)(過敏反應(yīng)),還能夠?qū)е卵装Y后期的炎癥細(xì)胞持續(xù)浸潤、組織重構(gòu)及纖維化,因此肥大細(xì)胞在過敏,炎癥,免疫反應(yīng)中都發(fā)揮著重要作用。肥大細(xì)胞的活化受細(xì)胞多種分子調(diào)控,FcεRI和KIT兩個跨膜受體在肥大細(xì)胞活化信號起始階段發(fā)揮關(guān)鍵作用。其中FcεRI在肥大細(xì)胞中高表達(dá),是肥大細(xì)胞活化調(diào)控中主要的膜受體。當(dāng)機(jī)體初次接觸致敏原,B細(xì)胞產(chǎn)生的特異性抗體IgE可與肥大細(xì)胞表面的FcεRI結(jié)合,促使FcεRI發(fā)生交聯(lián),使機(jī)體處于致敏狀態(tài)。當(dāng)同一致敏原再次刺激時,可經(jīng)IgE/FcεRI活化肥大細(xì)胞,最終引起顆粒內(nèi)組胺的釋放以及細(xì)胞因子的分泌,從而導(dǎo)致平滑肌收縮、毛細(xì)血管擴(kuò)張、通透性增加,引起過敏反應(yīng)。盡管對于肥大細(xì)胞活化的研究較多,但是針對參與肥大細(xì)胞活化關(guān)鍵分子的研究仍然是熱點之一。鑒于肥大細(xì)胞在過敏反應(yīng)中的關(guān)鍵作用,研究發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞活化的新調(diào)控因子對探討肥大細(xì)胞參與的過敏反應(yīng)具有重要意義。蛋白4.1R是1979年在成熟紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的80kDa細(xì)胞膜骨架蛋白分子。在紅細(xì)胞中存在兩種形式的蛋白4.1R:135kDa亞型(4.1R135)與80kDa亞型(4.1R80),分別表達(dá)于紅細(xì)胞的不同分化階段。4.1R是將紅細(xì)胞跨膜蛋白和血影蛋白-肌動蛋白蛋白骨架網(wǎng)絡(luò)連接起來的橋梁,對維持紅細(xì)胞的形狀、粘附、脆性及正常生理功能發(fā)揮重要作用。擁有FERM結(jié)構(gòu)域的蛋白被稱為蛋白4.1超家族,4.1超家族分為5個亞家族:4.1蛋白家族、ERM蛋白家族、踝蛋白相關(guān)分子、PTPH和NBL4蛋白。近年來研究發(fā)現(xiàn),4.1蛋白家族除了最初在成熟紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的80kDa的細(xì)胞膜骨架蛋白分子4.1R,還包括在有核細(xì)胞中廣泛表達(dá)的4.1N、4.1G、4.1B,其中4.1N主要分布在神經(jīng)系統(tǒng),4.1B主要分布在腦組織,4.1G廣泛分布,而4.1R則在紅細(xì)胞及同樣來源于骨髓多功能造血干細(xì)胞的T細(xì)胞、B細(xì)胞和肥大細(xì)胞等免疫細(xì)胞中高表達(dá)。本課題前期研究顯示蛋白4.1R通過抑制T細(xì)胞受體TCR介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對T淋巴細(xì)胞活化及增殖發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用,同時實驗組前期利用小鼠自身抗原MOG誘導(dǎo)小鼠實驗性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)模型,發(fā)現(xiàn)4.1R基因敲除小鼠對致敏原反應(yīng)更敏感。4.1R在不同細(xì)胞中的功能正在越來越多的被發(fā)現(xiàn),但是4.1R在固有免疫細(xì)胞,如肥大細(xì)胞,巨噬細(xì)胞等中的功能尚不清楚。研究目的本研究利用課題組已建立的4.1R基因敲除小鼠模型,研究4.1R基因缺失對IgE介導(dǎo)的體外肥大細(xì)胞活化和體內(nèi)過敏反應(yīng)性疾病的影響,證實細(xì)胞膜骨架蛋白4.1R是肥大細(xì)胞活化的重要調(diào)控因子,為闡明蛋白4.1R對肥大細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ),對理解和豐富有關(guān)肥大細(xì)胞活化與調(diào)控的理論具有重要意義。研究方法1.取4.1R~(+/+)和4.1R-/-C57BL/6J小鼠股骨和脛骨中的骨髓,用RPMI1640培養(yǎng)基重懸。體外培養(yǎng)四周后收集懸浮細(xì)胞,得到BMMC。甲苯胺藍(lán)染色,光鏡下比較4.1R~(+/+)和4.1R-/-BMMC生長形態(tài);用FITC標(biāo)記的anti-mouse FcεRIα抗體和PE標(biāo)記的anti-mouse CD117共染,流式細(xì)胞儀檢測分析肥大細(xì)胞純度。2.培養(yǎng)成熟的4.1R~(+/+)和4.1R-/-BMMC,提取總RNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA,PCR反應(yīng)及瓊脂糖電泳進(jìn)行基因型鑒定,測序鑒定肥大細(xì)胞中蛋白4.1R剪切體外顯子組成。3.利用吸光光度法研究4.1R基因缺失對IgE介導(dǎo)的BMMC脫顆粒的影響。4.利用qRT-PCR方法研究4.1R基因缺失對于BMMC炎癥因子IL-6、IL-4、IL-13和TNF-α在不同活化時間點轉(zhuǎn)錄水平的影響。5.利用qRT-PCR方法研究4.1R基因缺失對BMMC FcεRI在不同活化時間點轉(zhuǎn)錄水平的影響,利用流式細(xì)胞儀檢測分析4.1R基因缺失對BMMC表面FcεRIα表達(dá)的影響。6.建立4.1R~(+/+)和4.1R-/-C57BL/6J小鼠被動皮膚過敏反應(yīng)模型,吸光光度法比較兩種基因型小鼠耳部血管滲透性,將耳朵包埋切片,病理學(xué)觀察比較兩種基因型小鼠組胺釋放導(dǎo)致的耳部腫脹程度。7.建立4.1R~(+/+)和4.1R-/-C57BL/6J小鼠遲發(fā)相皮膚過敏反應(yīng)模型,比較兩種基因型小鼠耳厚耳重,將耳部包埋切片,病理學(xué)觀察比較小鼠耳部肥大細(xì)胞介導(dǎo)的炎性細(xì)胞浸潤程度,將切片進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色,顯微鏡下統(tǒng)計耳部肥大細(xì)胞脫顆粒率。并利用qRT-PCR方法比較兩種基因型小鼠耳部炎癥因子IL-6轉(zhuǎn)錄水平。研究結(jié)果1.培養(yǎng)成熟的4.1R~(+/+)和4.1R-/-BMMC經(jīng)過流式細(xì)胞儀檢測分析純度達(dá)到85%以上,可用于后續(xù)實驗,光鏡下觀察靜息狀態(tài)的兩種基因型BMMC生物學(xué)形態(tài)無差別。2.RT-PCR結(jié)果顯示,4.1R-/-C57BL/6J小鼠的BMMC中缺失4.1R 135kDa和80kDa。繪制BMMC中4.1R基因外顯子圖譜,與小鼠源4.1R完整外顯子序列比對分析,4.1R~(+/+)BMMC中蛋白4.1R 135kDa表達(dá)缺失外顯子3、14、15、16,蛋白4.1R 80kDa表達(dá)缺失外顯子14、15、16。3.吸光光度法結(jié)果顯示活化后4.1R-/-BMMC脫顆粒程度顯著高于4.1R~(+/+)BMMC。4.qRT-PCR結(jié)果顯示:4.1R-/-BMMC中的IL-6和IL-4、IL-13在刺激10min時轉(zhuǎn)錄水平顯著高于4.1R~(+/+)BMMC。5.qRT-PCR結(jié)果顯示:4.1R基因缺失后,在刺激10min、1hr時,FcεRIα、β、γ的mRNA表達(dá)水平顯著增加;但是兩種基因型BMMC膜表面FcεRIα表達(dá)并沒有差異。6.被動皮膚過敏反應(yīng)實驗結(jié)果顯示:4.1R-/-C57BL/6J小鼠耳部滲透出的伊文思藍(lán)染料量顯著高于4.1R~(+/+)小鼠,說明4.1R基因缺失后,C57BL/6J小鼠耳部組胺導(dǎo)致的血管滲透性增強(qiáng),病理切片結(jié)果顯示,4.1R-/-C57BL/6J小鼠耳部組胺導(dǎo)致的腫脹程度也顯著高于4.1R~(+/+)小鼠。7.遲發(fā)相皮膚過敏反應(yīng)實驗結(jié)果顯示:4.1R-/-C57BL/6J小鼠耳厚耳重顯著高于4.1R~(+/+)小鼠,4.1R基因缺失后,C57BL/6J小鼠耳部肥大細(xì)胞介導(dǎo)的炎性細(xì)胞浸潤程度顯著增強(qiáng),以及IL-6轉(zhuǎn)錄水平也顯著增高,但是耳部肥大細(xì)胞的脫顆粒率沒有顯著性差異。研究結(jié)論4.1R能夠抑制IgE介導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫顆粒和細(xì)胞因子的分泌,并且對過敏反應(yīng)性疾病發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。
[Abstract]:The activation of mast cells in mast cells plays an important role in the activation of mast cells . 4 . 1R ~ ( ++ ) and 4.1R ~ ( + ) and 4.1R - / - BMMC were used to study the effect of 4.1R gene deletion on IgE - mediated activation and proliferation of mast cells .

【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R392

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本文編號：1427517