發(fā)布時(shí)間：2018-01-12 17:46

  本文關(guān)鍵詞：前半胱天冬酶-1及活性位點(diǎn)突變真核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及生物活性鑒定　出處：《軍事醫(yī)學(xué)》2013年02期 　論文類型：期刊論文

  更多相關(guān)文章： 前半胱天冬酶- CA突變 炎癥反應(yīng) IL-β

【摘要】：目的構(gòu)建和表達(dá)前半胱天冬酶(procaspase)-1及其活性位點(diǎn)C285A突變真核表達(dá)載體,并檢測(cè)其生物學(xué)活性。方法從人胚腎細(xì)胞系HEK293中提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后,PCR獲得前半胱天冬酶-1全長(zhǎng)DNA,并通過重組PCR獲得其酶活性位點(diǎn)突變片段,酶切連接到載體pcDNA3-Flag中,經(jīng)鑒定將陽性克隆測(cè)序;脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染兩種載體到HEK293中表達(dá),用免疫印跡檢測(cè)目的蛋白的表達(dá),并用酶聯(lián)免疫吸附方法檢測(cè)在病原菌毒力蛋白刺激下,前半胱天冬酶-1及C285A對(duì)IL-1β分泌的影響。結(jié)果構(gòu)建的2種真核表達(dá)載體能夠在HEK293中很好表達(dá),當(dāng)前半胱天冬酶-1過表達(dá)時(shí),病原菌毒力蛋白可以刺激IL-1β的分泌,而C285A酶活性位點(diǎn)突變之后,IL-1β的分泌明顯降低。結(jié)論構(gòu)建重組的pcDNA3-Flag-procaspase-1具有生物學(xué)活性,而C285A突變導(dǎo)致前半胱天冬酶1喪失切割底物的功能,且使IL-1β的分泌明顯降低。
[Abstract]:Objective to construct and express the eukaryotic expression vector of procaspase1 and its active site C285A. Methods Total RNAs were extracted from human embryonic kidney cell line HEK293, and the first cysteinase-1 full-length DNA was obtained by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). The mutant fragment of the enzyme activity site was obtained by recombinant PCR and ligated into the vector pcDNA3-Flag. The positive clones were sequenced. The expression of the target protein was detected by Western blotting, and the virulence protein stimulated by pathogenic bacteria was detected by enzyme-linked immunosorbent assay (Elisa). Results the two eukaryotic expression vectors were well expressed in HEK293, and the current overexpression of C285A and C285A on the secretion of IL-1 尾 was observed. Virulence protein of pathogenic bacteria can stimulate the secretion of IL-1 尾, but after C285A enzyme activity site mutation. Conclusion the recombinant pcDNA3-Flag-procaspase-1 has biological activity. The mutation of C285A resulted in the loss of the substrates function and the decrease of the secretion of IL-1 尾.
【作者單位】： 安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院;軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所;
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31170029)
【分類號(hào)】：R341;Q55
【正文快照】： 半胱天冬酶(cysteinyl aspartate-specific protea-ses,Caspase)家族是一組存在于細(xì)胞質(zhì)中,活性位點(diǎn)均含半胱氨酸殘基,能夠特異性地切割靶蛋白的天冬氨酸殘基后肽鍵的蛋白酶。目前發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞caspase家族成員共有15種,其中caspase-1和14主要介導(dǎo)細(xì)胞因子的炎癥反應(yīng)[1]

【參考文獻(xiàn)】

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【共引文獻(xiàn)】

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【二級(jí)參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1415321