本文關鍵詞：RSV誘導Hep2細胞自噬在病毒復制中的作用及其機制研究　出處：《河北醫(yī)科大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：病毒侵入機體后,與宿主的相互作用與博弈決定著疾病的進程和轉歸。在二者相互作用過程中,自噬和凋亡機制發(fā)揮重要作用。自噬是真核生物中一種高度保守的細胞代謝過程,它通過溶酶體途徑對胞內(nèi)蛋白質(zhì)或受損細胞器進行降解,有助于維持細胞穩(wěn)態(tài),促進細胞存活。病毒感染可通過多種途徑誘導自噬,自噬在病毒和宿主細胞互作過程中發(fā)揮雙重作用:一方面,它通過多種方式發(fā)揮抗病毒作用,如活化TLR、促進病毒抗原加工處理和提呈、直接包裹并降解病毒等;而病毒作為一種專性的胞內(nèi)寄生微生物,在與宿主細胞長期博弈過程中,進化出一系列逃逸甚至策反自噬的機制以促進自身存活和復制,如阻止自噬體和溶酶體融合,重塑內(nèi)膜系統(tǒng)形成病毒膜相關復制“工廠”,下調(diào)免疫信號等。同自噬機制相同,凋亡在病毒和細胞互作過程中也發(fā)揮著“雙刃劍”的作用。凋亡是細胞在基因控制下啟動的一種主動的,有序的細胞死亡過程,細胞通過啟動這種主動“自殺”方式限制病毒的復制和傳播。而病毒在與其長期作用過程中,逐漸進化出多種利己的機制,促進自身復制和釋放,如:以更高的效率在凋亡細胞中復制;延遲、抑制細胞凋亡促進自身復制;通過在特定階段誘導凋亡而促進自身釋放和傳播。自噬和凋亡雖是兩種完全不同的生理過程,但越來越多的研究證據(jù)顯示:它們之間關系十分密切,可相互調(diào)控,甚至在特定條件下可相互轉化,二者之間的動態(tài)平衡影響著病毒的生存和致病。探討病毒和宿主細胞的相互作用是闡明病毒致病機理,開發(fā)抗病毒藥物和疫苗的重要基礎。呼吸道上皮細胞作為呼吸道的首道防御屏障,最先與呼吸道合胞病毒(RSV)相遇,而RSV與呼吸道上皮細胞是如何相互作用的,尚不清楚。我們以RSV作為模型病毒,從病毒和宿主細胞相互作用,從病毒、細胞自噬和凋亡相互調(diào)控角度出發(fā),研究RSV對呼吸道上皮細胞自噬水平的影響以及自噬對病毒增殖動力學的影響,并試圖從自噬和凋亡調(diào)控角度探討其可能的機制。為深入闡明RSV和呼吸道上皮細胞相互作用關系,開發(fā)新的靶向自噬的抗病毒治療方法奠定研究基礎。第一部分RSV感染對呼吸道上皮細胞自噬活性的影響目的:探討RSV感染對呼吸道上皮細胞自噬活性的影響方法:1 RSV對呼吸道上皮細胞自噬體形成的影響1.1不同感染復數(shù)(MOI=1、3、5)的RSV感染Hep2細胞4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h,Western blot檢測自噬標志蛋白LC3Ⅱ的表達變化,確定RSV誘導自噬的MOI及時間。1.2 RSV感染Hep2細胞24 h、36 h、48 h,Western blot檢測Atg12-Atg5泛素化系統(tǒng)活化情況及自噬相關蛋白Atg5、ATG7、Beclin1表達情況。1.3 p BABE-puro-EGFP-LC3質(zhì)粒瞬時轉染Hep2細胞24h后,RSV(MOI=5)再感染24 h,熒光顯微鏡觀察胞漿EGFP-LC3蛋白的分布情況。1.4 RSV感染Hep2細胞24 h,透射電鏡觀察細胞內(nèi)自噬體形成情況。2.RSV對呼吸道上皮細胞自噬流活性的影響2.1 RSV感染Hep2細胞24 h、48 h,Western blot檢測細胞P62蛋白表達情況;2.2 10 n M巴弗洛霉素(bafilomycin A1,baf A1)預處理細胞2 h,RSV再感染24 h,Western blot檢測細胞LC3Ⅱ及P62蛋白的表達。3 RSV感染對balb/c鼠肺組織自噬水平的影響SPF級6周齡balb/c鼠,經(jīng)滴鼻感染RSV(106 PFU/只),分為8組,每組5只,分別于感染0天、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天將其處死,Western blot檢測肺組織LC3Ⅱ蛋白的表達情況。結果:1 RSV誘導Hep2細胞自噬體數(shù)量增加1.1 RSV感染Hep2細胞,自24 h起自噬標志蛋白LC3Ⅱ表達開始明顯升高,一直持續(xù)至檢測時間點48 h(P0.05)。1.2 RSV感染Hep2細胞24 h、36 h和48 h,ATG12-ATG5復合物及自噬相關蛋白Atg5,ATG7,Beclin表達明顯增高(P0.05)。1.3 RSV感染改變Hep2細胞胞漿EGFP-LC3蛋白的分布,從均勻分布改為點狀聚集分布。1.4透射電鏡觀察顯示:RSV感染致Hep2細胞胞漿內(nèi)形成大量雙層膜自噬體結構。2 RSV誘導Hep2細胞完全的自噬流反應2.1 RSV感染Hep2細胞48 h,自噬流標志蛋白P62表達明顯下降(P0.05)。2.2與單純RSV感染比較,baf A1(10 n M)處理明顯增加Hep2細胞LC3Ⅱ和P62表達水平(P0.05)。3 RSV誘導Balb/c鼠肺組織自噬增強RSV滴鼻感染Balb/c鼠,自3天起鼠肺組織LC3Ⅱ蛋白的表達明顯增高,持續(xù)至檢測時間點7天(P0.05)第二部分RSV通過ROS-AMPK-m TOR通路誘導Hep2細胞自噬目的:探討ROS在RSV誘導呼吸道上皮細胞自噬中的作用及參與的信號分子方法:1 RSV感染Hep2細胞6 h、12 h、24 h,DCFH-DA探針法檢測胞內(nèi)活性氧(ROS)的水平。2 5 m M ROS抑制劑N-acetyl-l-cysteine(ROS抑制劑)預處理細胞2 h,RSV再感染24 h,Western blot檢測LC3Ⅱ蛋白的表達,探討ROS與自噬的關系。3 RSV感染Hep2細胞,取不同的時間點,Western blot檢測信號分子p-AMPK、p-m TOR、p-ERK、p-JNK的表達變化。4分別用5μM Compoud C(p AMPK抑制劑)、10μM SP600125(JNK抑制劑)、10μM PD98059(ERK抑制劑)預處理Hep2細胞1 h,RSV再感染24 h,Western blot檢測LC3Ⅱ的表達變化,探討參與自噬誘導的信號通路。5 m M N-acetyl-l-cysteine預處理細胞2 h,RSV再感染24 h,Western blot檢測p-AMPK,p-mTOR和LC3Ⅱ的表達變化,明確ROS與AMPK信號通路的關系。明確參與ROS依賴自噬誘導的主要信號通路。結果:1 RSV感染Hep2細胞,自6 h起胞內(nèi)活性氧(ROS)水平開始增加,12 h明顯增加,一直持續(xù)至檢測時間點24 h。2 N-acetyl-l-cysteine(ROS抑制劑)可抑制RSV誘導的Hep2細胞LC3Ⅱ的高表達(P0.05),提示RSV通過ROS依賴機制誘導自噬。3 RSV感染Hep2細胞,信號分子p-AMPK的表達自6 h起明顯升高,一直持續(xù)至檢測時間點24 h(P0.05);p-m TOR的表達自6 h起明顯降低,一直持續(xù)至檢測時間點24 h(P0.05);MAPK通路的信號分子p-ERK的表達于30 min明顯升高,一直持續(xù)至24 h(P0.05);p-JNK的表達于30 min明顯升高(P0.05)。4 JNK抑制劑SP600125和ERK抑制劑PD98059不能抑制RSV誘導的Hep2細胞LC3Ⅱ的高表達(P0.05);AMPK抑制劑Compound C可逆轉RSV誘導的Hep2細胞p-m TOR的低表達(P0.05)和LC3Ⅱ的高表達(P0.05)。提示AMPK-m TOR信號通路參與RSV誘導的自噬。N-acetyl-l-cysteine可逆轉RSV誘導的Hep2細胞p-AMPK的高表達,p-m TOR的低表達(P0.05)和LC3Ⅱ的高表達(P0.05)。提示ROS位于AMPK-m TOR分子的上游調(diào)控RSV誘導的自噬。第三部分RSV誘導的細胞自噬通過抑制細胞凋亡促進病毒復制目的:探討RSV誘導的細胞自噬對病毒增殖動力學的影響及其可能的機制方法:1 RSV誘導的Hep2細胞自噬對病毒增殖動力學的影響1.1分別用不同濃度的化學自噬誘導劑雷帕霉素(rapamycin)和化學自噬抑制劑3-甲基腺苷(3-MA)或渥曼青霉素(wortmannin)預處理Hep2細胞2 h,RSV再感染24 h,Western blot檢測LC3Ⅱ的表達變化,確定后續(xù)試驗應用濃度。分別用100 n M rapamycin,1 m M 3-MA,100 n M wortmannin預處理p BABE-puro-EGFP-LC3質(zhì)粒瞬時轉染的Hep2細胞2h,RSV再感染24 h,熒光顯微鏡觀察胞內(nèi)EGFP-LC3蛋白點狀聚集情況,驗證其誘導和抑制自噬的效果。1.2分別用100 n M rapamycin,1 m M 3-MA,100 n M wortmannin預處理細胞2 h后,RSV再感染24 h或48 h,熒光定量PCR檢測胞內(nèi)病毒基因表達水平,Western blot檢測胞內(nèi)RSV F蛋白的表達變化,滴定細胞上清病毒滴度,從上述三方面評估自噬誘導和自噬抑制對病毒增殖動力學的影響。1.3構建針對Atg5,Atg7和Beclin1的sh RNA干擾質(zhì)粒,包裝慢病毒感染Hep2細胞,建立干擾Atg5,Atg7和Beclin1的穩(wěn)定Hep2細胞系。以Hep2和Hep2-sh-luciferase為對照,Western blot檢測Atg5,Atg7和Beclin1蛋白表達,驗證其干擾效果;RSV感染上述細胞24 h,Western blot檢測LC3Ⅱ的表達變化,進行功能驗證。1.4 RSV感染Hep2-sh-Atg5,Hep2-sh-Atg7,Hep2-sh-Beclin和Hep2-sh-luciferase細胞24 h或48 h,熒光定量PCR檢測細胞內(nèi)病毒基因表達水平,Western blot檢測胞內(nèi)RSV F蛋白的表達變化,滴定細胞上清病毒滴度,從上述三方面評估干擾自噬相關基因抑制自噬對病毒增殖動力學的影響。2細胞自噬通過影響RSV誘導的細胞凋亡促進病毒復制2.1 1m M 3-MA預處理Hep2細胞2 h,RSV再感染48 h,Western blot檢測full length casepase 3,cleaved-casepase 3,PARP,cleaved-PARP蛋白的表達變化;Annexin V-PE/7-AAD染色后經(jīng)流式細胞術檢測細胞凋亡率,觀察3-MA抑制自噬對RSV誘導凋亡的影響。2.2 RSV感染Hep2-sh-Atg5,Hep2-sh-Beclin1穩(wěn)轉細胞株48 h,與Hep2-sh-luciferase比較,Western blot檢測full length casepase 3,cleaved-casepase 3,PARP,cleaved-PARP蛋白的表達變化,觀察干擾上述基因表達抑制自噬對RSV誘導凋亡的影響。2.3 Atg5 si RNA或Beclin1 si RNA轉染Hep2細胞24 h,RSV再感染48 h,與Negtive control si RNA轉染的對照細胞比較,FITC-Annexin V/PI染色后經(jīng)流式細胞術檢測細胞凋亡率。2.4 1m M 3-MA預處理Hep2細胞2 h后,RSV再感染,于病毒吸附2h后,在3-MA處理孔中加入50μM凋亡抑制劑Z-VAD-FMK,繼續(xù)感染至48 h,Western blot檢測RSV F蛋白的表達變化;同時收集細胞上清進行病毒滴定。探討凋亡抑制劑Z-VAD-FMK是否可逆轉3-MA抑制自噬對病毒復制造成的影響。2.5 RSV感染Hep2-sh-Atg5和Hep2-sh-Beclin細胞,病毒吸附2 h后,分別加入50μM廣譜凋亡抑制劑Z-VAD-FMK,繼續(xù)感染至48 h,Western blot檢測RSV F蛋白的表達變化;同時收集細胞上清進行病毒滴定。探討凋亡抑制劑Z-VAD-FMK是否可逆轉敲低自噬相關基因抑制自噬對病毒復制造成的影響。結果:1促進自噬有助于病毒復制;抑制自噬不利于病毒復制1.1經(jīng)過系列相關實驗,確定自噬誘導劑rapamycin和自噬抑制劑3-MA或wortmannin的最佳作用濃度并驗證其效果。它們的最佳作用濃度分別為:100 n M,1 m M和100 n M。1.2與RSV單獨感染比較,100 n M rapamycin處理可顯著增加胞內(nèi)病毒M、N、L、G、F、M2、NS1基因的表達水平(P0.05);顯著增加RSV F蛋白的表達(P0.05);顯著增加細胞上清病毒滴度(P0.05)。1 m M 3-MA或100 n M wortmannin處理細胞,結果與之相反。1.3成功建立干擾Atg5,Atg7,Beclin 1的穩(wěn)定細胞系Hep2-sh-Atg5,Hep2-sh-Atg7和Hep2-sh-Beclin 1和干擾luciferase的對照細胞系Hep2-sh-luciferase,經(jīng)Western blot驗證,干擾效果明顯;功能驗證結果顯示:干擾上述基因可明顯抑制RSV誘導的自噬。1.4干擾Atg5、Atg7和Beclin 1基因表達抑制自噬不利于RSV復制與Hep2-sh-luciferase細胞比較,RSV感染Atg5、Atg7和Beclin敲低表達的Hep2細胞,可顯著降低胞內(nèi)病毒M、N、L、G、F、M2、NS1基因的表達水平(P0.05);顯著降低RSV F蛋白的表達(P0.05);顯著降低細胞上清病毒滴度(P0.05)。2抑制自噬使RSV誘導的細胞凋亡明顯增加2.1與RSV單獨感染組比較,3-MA處理組cleaved-casepase 3及cleaved-PARP的表達水平顯著提高(P0.05);凋亡率顯著提高(P0.05)。2.2與Hep2-sh-luciferase對照細胞比較,RSV感染的Hep2-sh-Atg5或Hep2-sh-Beclin 1細胞cleaved-casepase 3及cleaved-PARP表達水平顯著提高(P0.05);2.3經(jīng)FITC-Annexin V/PI染色,流式細胞術檢測顯示:si RNA轉染Hep2細胞敲低Atg5或Beclin1的表達可致RSV誘導的細胞凋亡率明顯提高(P0.05)。3凋亡抑制劑Z-VAD-FMK可部分逆轉因自噬抑制所引起的病毒復制降低,提示自噬通過抑制細胞凋亡而助于病毒復制。3.1與3-MA單獨處理組比較,Z-VAD-FMK和3-MA聯(lián)合處理組RSV感染Hep2細胞的RSV F蛋白的表達和細胞上清病毒滴度明顯提高(P0.05)。3.2 RSV感染Hep2-sh-Atg5、Hep2-sh-Beclin 1細胞,經(jīng)Z-VAD-FMK處理,RSV F蛋白的表達和細胞上清病毒滴度與單獨RSV感染組比較明顯升高(P0.05)。凋亡抑制劑Z-VAD-FMK可部分逆轉因自噬抑制所引起的病毒復制降低,提示自噬通過抑制細胞凋亡而助于病毒復制。結論:1 RSV感染可誘導Hep2細胞完全的自噬流反應。2 RSV感染可誘導Balb/c鼠肺組織自噬水平增高。3 RSV通過ROS依賴的AMPK-m TOR通路活化誘導Hep2細胞自噬。4 RSV利用細胞自噬抑制細胞凋亡進而促病毒自身復制。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R392

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本文編號：1415273